Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Analiza plastičnosti dendritičkih trnova hipokampalnih zrnatih stanica nakon eksperimentalno inducirane denervacije u modelu miša (ADSPINE)
Naslov projekta na engleskom jeziku: Analysis of dendritic spine plasticity in hippocampal granule cells following experimentally induced denervation in the mouse model
Voditeljica projekta: prof. dr. sc. Mario Vukšić
Ustrojbena jedinica: Hrvatski institut za istraživanje mozga, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 16. prosinca 2024. do 15. prosinca 2027. 36 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 169.604,01 €
Poziv i kod projekta: HRZZ Istraživački projekti (IP); IP-2024-05-5754
Opis projekta
Dinamika i mehanizmi oporavka neurona nakon moždane traume ostaju ključno i neriješeno pitanje u modernoj neuroznanosti, pri čemu trenutno ne postoje farmakološke intervencije s kojima bi učinkovito tretirali pacijente. Otkrivanje temeljnih mehanizama kako se neuralni krugovi reorganiziraju ključno je za identificiranje novih terapijskih ciljeva u tih bolesnika. Takva otkrića značajno bi utjecala na strategije koje se koriste u rehabilitaciji i fizioterapiji nakon traumatske ozljede mozga (TOM). Incidencija TOM u gusto naseljenoj Europskoj uniji je umjereno visoka (od 83,3 do 849 (prosječna vrijednost 258) na 100,000 stanovnika godišnje u regionalnim studijama), sa značajnim dijelom populacije koji preživi ozljedu (od 3,3 do 24,4 na 100,000 stanovnika godišnje). S obzirom na navedeno, nova saznanja o ključnim neuralnim procesima uključenima u oporavak od ozljede mozga mogla bi poboljšati kliničke ishode i smanjiti dugoročnu invalidnost za mnoge pojedince (Brazinova i sur., 2021).
U ovom projektu namjeravamo istražiti strukturne promjene koje se događaju na razini dendritičkih trnova u mozgu nakon deaferentacije, oponašajući post-traumatsku reorganizaciju neurona. Granasti produžeci neurona, koje nazivamo dendriti, posebno su dizajnirani za primanje i integriranje elektrokemijskih signala formiranjem sinaptičkih veza s drugim neuronima. Te strukture su ključne za prijenos neuralnih informacija, stoga olakšavaju komunikaciju u mozgu. Arhitektura dendritičkog stabla pokazuje značajnu korelaciju s neuronalnom funkcijom. Mjerenjem morfoloških parametara poput ukupne dužine dendrita, broja grana i indeksa razgranatosti možemo procijeniti funkcionalno stanje istraživanog neurona (Tavosanis, 2012). Dendriti neurona su primarni primatelji ekscitatornog ulaza u stanicu, s vezama koje završavaju na sitnim izbočinama koje izviru iz dendrita nazvanim dendritički trnovi. Oni su vrlo plastični i njihova veličina i oblik se stalno mijenjaju kao odgovor na neuronalnu aktivnost (Nakahata & Yasuda, 2018). Dendritički trnovi, često opisano kao najmanje integrativne jedinice živčanog sustava, igraju ključnu ulogu u pohranjivanju sinaptičke snage i prenošenju dolaznih informacija u tijelo neurona (Shepherd 1996, Tønnesen i Nägerl, 2016). Po dostizanju zrelosti, svaki dendtritički trn tipično sadrži ekscitatornu sinapsu sadržavajući AMPA receptore potrebne za normalan sinaptički prijenos i NMDA receptore potrebne za većinu procesa plastičnosti koji se događaju na sinapsi (Malinow i Malenka, 2002; Bourne & Harris, 2008). Promjena u veličini, broju i ukupnoj površini dendritičkih trnova usko je povezana s funkcionalnim promjenama na sinaptičkoj razini i predstavlja promjene u broju AMPA receptora smještenih na postsinaptičkoj gustoći (Matsuzaki i sur., 2001; Kasai i sur., 2003; Asrican i sur., 2007; Alvarez i Sabatini, 2007). Dendritički trnovi pokazuju izrazito visoku stopu promjene. Životni vijek pojedinačnih trnova znatno varira; dok neki stabilni trnovi mogu opstati najmanje mjesec dana, drugi postoje samo nekoliko dana, što odražava njihovu dinamičnu prirodu (Trachtenberg i sur., 2002; Berry i Nedivi, 2017). Ova varijabilnost u preživljenju trnova kritična je, jer omogućuje kontinuirano remodeliranje sinaptičkih veza, što je neophodno za plastičnost unutar neuronske mreže. Funkcionalne promjene unutar ovih mreža zahtijevaju ne samo promjenu u snazi i učinkovitosti postojećih sinapsi, već i restrukturiranje neuralne povezanosti kroz formiranje novih trnova i eliminaciju starih (Majewska i sur., 2006). Nadalje, procesi strukturne plastičnosti u dendritičkim trnovima služe kao lokalizirani mehanizam koji olakšava brze prilagodbe u mreži. Te prilagodbe su ključne za početno kodiranje sjećanja i njihovo dugoročno skladištenje, omogućujući dendritičkim trnovima da igraju središnju ulogu u brzoj formaciji pamćenja i održavanju postojanih sjećanja (O'Donnell i sur., 2011; van der Zee, 2015; Gonzales-Tapia i sur., 2020). Stoga, dinamično restrukturiranje dendritičkih trnova podržava kognitivne funkcije kao što su učenje i pamćenje, ilustrirajući složenu međuigru između strukturnih promjena u neuronima i kognitivnih procesa.
Sinaptopodin (SP) je protein vezan uz aktin koji se nalazi u spinoznom aparatu (SA), specijaliziranom obliku glatkog endoplazmatskog retikuluma prisutnom u malom podskupu dendritičkih trnova (oko 10-15%), smještenom na bazi glave trna (Spacek 1985; Deller i sur., 2000; 2003). Kroz svoje djelovanje na SA, SP igra ključnu ulogu u modulaciji kalcijevih (Ca2+) prolaznih struja unutar dendritičkih trnova koji utječu na snagu i učinkovitost sinaptičkih veza kao odgovor na neuronsku aktivnost (Korkotian i Segal, 2011). Osim toga, SP utječe na dinamiku drugih posrednika kao što su cAMP i IP3, utječući na različite dugotrajne procese u neuronima, od izražavanja gena do preuređenja citoskeleta (Cugno i sur., 2019). U našim nedavnim istraživanjima, nalazi su pokazali da je prisutnost SP-a u dendritičkim trnova značajno povezana s njihovom dugoročnom preživljavanjem i stabilnošću (Yap i sur., 2020). Utjecaj SP-a na preživljavanje i stabilnost trnova veći je od učinaka koji se mogu pripisati samo veličini trna koji sadrži SP (Kasai i sur., 2010), ističući njegovu važnost izvan samih strukturnih dimenzija i usmjeravajući naš fokus na dinamiku prisutnosti SP-a u dendritičkim trnovima. Također smo pokazali da trnovi koji sadrže SP sudjeluju u homeostatskom povećanju veličine trnova u miševa s konstitutivnom genetskom delecijom faktora nekroze tumora (TNF) ili TNF-receptora 1 (TNF-R1) (Smilovic i sur., 2022, 2023). Budući da TNF i TNF-R1 imaju ključnu ulogu u plastičnosti trnova, to sugerira da se prisutnošću SP-a može nadoknaditi odsutnost ključnih signalnih procesa u regulaciji morfologije dendritičkih trnova.
Protein Arc igra nezamjenjivu ulogu u nekoliko neurofizioloških procesa koji su ključni za utvrđivanje pamćenja, dugotrajno potenciranje (LTP), dugotrajnu depresiju (LTD) i homeostatsko skaliranje sinapsi (Shepherd i sur., 2006). Na molekularnoj razini, mRNA translacija Arc proteina se događa na razini specifičnih trnova (Dynes i Steward, 2012), gdje proizvedeni protein ulazi u međudjelovanje s raznim proteinima unutar trnova, olakšavajući dvostruku regulaciju snage sinapsi (Nikolaienko i sur., 2017; Newpher i sur., 2017). Jedan od ključnih mehanizama kojima Arc utječe na snagu sinapsi je promicanje internalizacije AMPA receptora, čime se smanjuje sinaptička snaga (Chowdhury i sur., 2006; Rial Verde i sur., 2006). Osim toga, Arc doprinosi modulaciji morfologije trnova kroz mehanizme sinaptičkog skaliranja, ključnu prilagodljivu reakciju na produljene promjene u neuronskoj aktivnosti, osiguravajući da sinaptički izlazi ostanu unutar funkcionalnih granica (Peebles i sur., 2010; Siddoway i sur., 2014; Zhang i Bramham, 2020).
Jedinstveni podskup dendritičkih trnova sadrži i ekscitatorne i inhibitorne sinapse, te tipično predstavlja izrazito stabilne i veće dendritičkih trnova. Suživot oba tipa sinapsi unutar jednog trna omogućava jaču lokaliziranu kontrolu nad neuronskom pobudnošću, time fino podešavajući omjer pobude i inhibicije na mjestu sinaptičkog ulaza (Villa i sur., 2016; Gemin i sur., 2021). Ovo svojstvo dvostruke inervacije mijenja mehanizme plastičnosti pojedinačnih trnova i može ih predisponirati za potpuno drugačiju vrstu interneuronalne interakcije (Kleinjan et al., 2023), podržavajući ukupnu stabilnost i veličinu dendritičkih trnova s dvostrukom inervacijom. Gephirin je temeljni protein koji sidri i stabilizira GABA receptore, time održavajući strukturni integritet inhibitornih sinapsi. Ova specifična svojstva sinapsi čine gephirin široko korištenim biljegom inhibitornih sinapsi u središnjem živčanom sustavu (Essrich et al., 1998; Choii & Ko, 2015; Hoffmann & Milovanovic, 2021).
Hipokampus se odlikuje jasno definiranom staničnom organizacijom i preciznom anatomijom svojih sinaptičkih veza, što ga čini idealnim modelom za proučavanje neuralnih krugova i odgovora na ozljede. Primarne aferentne veze u hipokampus dolaze iz entorinalnog korteksa, koji šalje aksonе kroz perforantni put, te koji završava na udaljenim dendritima zrnatih stanica u molekularnom sloju girusa dentatusa (Watson i sur., 2012). Ova anatomska specifičnost omogućava korištenje transekcije perforantnog puta kao pouzdanog modela za proučavanje denervacije u mozgu. Takva transekcija učinkovito izolira zrnate stanice od njihovog primarnog ulaza (Diekmann i sur., 1996). Ovaj izolirani gubitak aferentnih veza omogućava precizno praćenje promjena u plastičnosti neurona i kompenzacijskih mehanizama u zrnatim stanicama bez aktiviranja lokalne upale koja bi mogla blizu mjesta lezije (Perederiy i Westbrook, 2013). Iako je značajan dio istraživanja usmjeren na utjecaj lezije na morfologiju dendritičkih stabala, ostaje nepoznato kako su sami dendritički trnovi pogođeni (Phinney i sur., 2004; Vukšić i sur., 2011). Oštećenje entorinalnog korteksa ne samo da narušava povezanost hipokampusa, već utječe i na ponašanje životinja, posebno u odnosu na funkcije pamćenja. Na primjer, štakori s obostranim lezijama entorinalnog korteksa pokazuju povećanu aktivnost u testovima otvorenog polja, koja se vraća na preoperativne razine otprilike 11 dana nakon lezije (Steward i sur., 1977). Ovaj obrazac ponašanja može odražavati homeostatski proces oporavka sličan gubitku i kasnijem oporavku morfologije dendritičkih trnova na zrnatim stanicama, sugerirajući sličnu osnovnu dinamiku. Osim toga, sposobnosti dohvaćanja nedavno stečenog i starijeg sjećanja su narušene u akutnoj fazi nakon lezije (Hales i sur., 2018). Međutim, dugoročna dinamika mogućeg oporavka funkcije pamćenja nije dovoljno istražena.
Nakon TOM, denervirani neuroni prolaze re-inervaciju sustavima aferentnih vlakana koji završavaju u blizini. Istovremeno, ti neuroni se upuštaju u opsežno preuređenje svoje dendritičke arhitekture. Pokazali smo da u ranom stadiju nakon denervacije dendritičko stablo neurona pokazuje atrofiju zajedno s privremenim gubitkom dendritičkih trnova. Kod miševa, djelomičan oporavak nastupa nakon dužeg vremenskog razdoblja, pri čemu gustoće dendritičkih trnova dostižu razine prije ozljede, a ukupna duljina dendrita djelomično se oporavlja na otprilike 70% u usporedbi s kontrolama (Vukšić i sur., 2011). Također smo pokazali da dendritičko smanjenje ispunjava homeostatsku funkciju, jer neuroni čija su dendritička stabla podvrgnuta smanjenju pokazuju povećanu mogućnost ekscitacije na početku procesa, potencijalno kompenzirajući gubitak aferentnih ulaza povećanjem svoje ekscitacije (Platschek i sur., 2016). Nadalje, korištenje računalnog modeliranja omogućilo nam je da istaknemo kako poboljšana ekscitabilnost omogućava neuronima da održe funkcionalni kapacitet unatoč smanjenom volumenu dendrita. Sinaptičko skaliranje predstavlja ključan homeostatski proces kojim neuroni prilagođavaju funkcionalnu snagu svih svojih sinapsi jednoliko kao odgovor na značajne akutne promjene u razinama aktivnosti. Taj mehanizam postaje posebno relevantan nakon akutnih poremećaja, kao što je drastično smanjenje ekscitatornih ulaza u zrnate stanice zbog transekcije perforantnog puta (Turrigiano 2012; Lenz i sur., 2019, Del Turco i sur., 2023). Takva sinaptička prilagodba osigurava da neuronalna funkcija ostane stabilna unatoč promjenama u sinaptičkoj aktivnosti, ističući prilagodljivost i otpornost neuralnih krugova.
Cilj ovog projekta usmjeren je na promjene morfoloških parametara dendritičkih trnova u odraslih mužjaka miševa nakon lezije entorinalnog korteksa, u vremenskim točkama koje obuhvaćaju akutne, subakutne i kronične faze nakon ozljede. Studija će uključivati miševe s konstitutivnom genetskom delecijom SP-a kako bi se razjasnila njegova funkcija u oporavku od ozljede. Dodatno, testovi ponašanja će se koristiti za praćenje funkcionalnih promjena u tim miševima tijekom produljenog razdoblja nakon lezije, a računalno modeliranje će nam pomoći zaključiti funkcionalna svojstva tih neurona. Zaključno, dendritički trnovi su potrebni za omogućavanje neuronske komunikacije. Morfološke promjene trnova nakon ozljede ukazuju na prilagodbe unutar neuronskog sustava radi sprječavanja daljnjeg gubitka neurona. Unatoč intenzivnim studijama o funkciji dendritičkih trnova, interakcije između njegovih ključnih molekularnih komponenti i efektora, uključujući sinaptopodina, Arc-a i gephirina, ostaju slabo shvaćene. Nedavna otkrića kao što je uloga SP-a u dugoročnom preživljavanju dendritičkih trnova (Yap i sur., 2020), zajedno s istraživanjima dinamike gephyrina (Villa i sur., 2016) i proteina reguliranog aktivnošću Arc (Korb i Finkbeiner, 2011), omogućit će nam povezivanje morfoloških promjena u dendritičkim trnovima s homeostatskim oporavkom i podstaničnom reorganizacijom nakon cerebralne ozljede. Konačno, praćenje ovih promjena kroz akutne, subakutne i kronične faze poboljšat će naše razumijevanje neuralne prilagodbe i mehanizama koji potiču procese oporavka. Proučavanjem anatomije ovih podstaničnih struktura, cilj nam je razviti ključne alate za praćenje funkcionalnih promjena u neuronima. Ovaj projekt neće samo proširiti naše razumijevanje mehanizama odgovora neurona, već će i utrti put budućim intervencijama za ublažavanje učinaka ozljeda središnjeg živčanog sustava, doprinoseći razvoju učinkovitih terapijskih strategija. Ovaj prijedlog je nastavak našeg dugoročnog istraživanja mehanizama koji upravljaju sinaptičkom plastičnošću nakon lezije.
Ciljevi projekta
Opći cilj
Sustavno istražiti vremenski ovisne strukturne, molekularne i funkcionalne promjene dendritičkih trnova zrnatih stanica girusa dentatusa miša nakon denervacije uzrokovane lezijom entorinalnog korteksa, s posebnim naglaskom na ulogu sinaptopodina u stabilnosti i plastičnosti sinapsi. Projekt integrira kvantitativnu konfokalnu mikroskopiju, analizu sinaptičkih proteina, ponašajne testove te računalno i kompartmentalno modeliranje kako bi se povezale promjene na razini dendritičkih trnova s neuronalnom aktivnošću i ponašanjem u akutnim, subakutnim i kroničnim fazama nakon ozljede.
Specifični ciljevi
1. Procijeniti vremenski tijek morfoloških promjena dendritičkih trnova denerviranih zrnatih stanica nakon lezije entorinalnog korteksa in vivo u akutnim, subakutnim i kroničnim fazama nakon ozljede te usporediti morfološke promjene u dendritičkim trnovima između miševa s nedostatkom sinaptopodina i miševa divljeg tipa u određenim vremenskim točkama nakon lezije entorinalnog korteksa, kao i o drediti utjecaj nedostatka sinaptopodina na stabilnost i plastičnost dendritičkih trnova kao odgovor na denervaciju.
2. Evaluirati adaptacije u ponašanju miševa nakon lezije entorinalnog korteksa putem testova otvorenog polja i spontane alternacije u T-labirintu, povezujući ova ponašanja s morfološkim promjenama u dendritičkim trnovima.
3. Izvesti konfokalno snimanje označenih dendritičkih segmenata i koristiti ImageJ za precizno kvantificiranje morfoloških parametara dendritičkih trnova u različitim fazama nakon lezije kod miševa s nedostatkom sinaptopodina i miševa divljeg tipa.
4. Istražiti lokalnu i kolokaliziranu ekspresiju sinaptičkih proteina sinaptopodina za stabilnost, Arc za aktivnost i gephirin za prisutnost inhibitornih sinapsi unutar dendritičkih trnova koristeći ImageJ, analizirajući promjene u distribuciji sinaptičkih proteina u različitim fazama nakon lezije.
5. Koristiti računalno modeliranje za predviđanje dugoročnih promjena u morfologiji dendritičkih trnova i nakupina sinaptopodina, Arc-a i gephirina u denerviranim zrnatim stanicama do dvanaest mjeseci nakon lezije, kao i koristiti kompartmentalno modeliranje za simulaciju aktivnosti zrnatih stanica na temelju javno dostupnih rekonstrukcija zrnatih stanica i vlastitih podataka o morfologiji dendritičkih trnova, kroz različite faze nakon lezije.
Metodologija projektnog istraživanja
Plan istraživanja
Morfološke posljedice ozljede i denervacije na zrnate stanice girusa dentatusa sustavno će se istraživati na podstaničnoj razini ex vivo u odraslih mužjaka miševa s nedostatkom sinaptopodina u usporedbi s njihovim divljim tipom. Miševi, u dobi od 10 do 24 tjedna, podvrgnut će se analizama u više vremenskih točaka nakon lezije, tj. 3, 7, 14 i 28 dana nakon lezije entorinalnog korteksa (ECL). Provest ćemo opsežnu morfološku analizu na intracelularno označenim dendritičkim trnovima zrnastih stanica dentatnog girusa. Uključit će procjenu lokacije klastera sinaptopodina, Arca i gephirina te analizu njihove kolokalizacije. Implementirat ćemo trodimenzionalno snimanje putem konfokalne mikroskopije, dopunjeno ručnom morfološkom analizom identificiranih struktura. Promjene ponašanja kod miševa procijenit će se korištenjem testova otvorenog polja i spontane alternacije u T-labirintu. Stereotaksične operacije, anestezija i perfuzija obavljat će se u skladu s protokolima odobrenima od strane Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
Životinje
U eksperimentima će se koristiti odrasli mužjaci miševa (starosti 10 – 24 tjedna) kojima nedostaje sinaptopodin (SP-KO, C57BL/6J pozadina, The Jackson Laboratory; RRID: IMSR_JAX:028822) i miševi divljeg tipa (WT, C57BL/6J pozadina, The Jackson Laboratory; RRID: IMSR_JAX:000664). Smješteni će biti u kavezima u ventiliranim ormarima koji osiguravaju konstantnu temperaturu (22-24°C) i vlažnost (40-60%), smješteni u klimatiziranoj prostoriji s 12-satnim ciklusom svjetla i tame, s hranom i vodom dostupnom ad libitum, u Vivariju Hrvatskog instituta za istraživanje mozga, Medicinski fakultet, Sveučilište u Zagrebu. Činit će se svaki napor da se smanji stres i bol životinja.
Lezija entorinalnog korteksa in vivo
Naša istraživačka skupina uspješno je uspostavila i testirala ovaj postupak (Del Turco i sur., 2023). Nakon anestezije i analgezije mješavinom 10% ketamina (Narkamon 100 mg/mL, Bioveta) i 5% ksilazina (Xylased Bio 20 mg/mL, Bioveta) u dozi od 0,1 mL/10 g, miševi će biti postavljeni na stereotaksični okvir (Model 300, David Kopf Instruments). Na oči će biti primijenjen hidratantni gel (Recugel, Bausch + Lomb) kako bi se spriječilo oštećenje zbog dehidracije, dok će miševi biti postavljeni na sustav za homotermičko praćenje (Thermostar, ConductScience) kako bi se pratila i korigirala tjelesna temperatura. Kirurško područje će biti dezinficirano 2% klorheksidinom, a na dorzalnoj strani lubanje napravit će se rez kroz kožu i potkožno tkivo kako bi se otkrilo područje lubanje, nakon čega će se pomoću zubnog svrdla (UMXL-TM, NSK-Nakanishi Inc.) pričvršćenog na kontrolnu jedinicu (ULTIMATE XL-K, NSK-Nakanishi Inc.) uz pomoć kirurškog mikroskopa (OPMI pico, Zeiss) otvoriti prozor u mozak. Za ulazak u područje interesa koristit će se stereotaksični uvlačivi žičani nož (M121, McHugh Milieux) montiran na nosač žičanog noža (M120, McHugh Milieux), gdje će biti pozicioniran za jednostranu transekciju lijevog perforantnog puta koji povezuje entorinalni korteks s hipokampusom. Nakon ozljede, nož će biti izvađen. Rana će biti zašivena, dezinficirana 10% povidon-jodom (Betadine 10%, Alkaloid) i na područje operacije će biti primijenjeni lokalni analgetici kako bi se smanjila bol. Antibiotik enrofloksacin (Baytril 50 mg/mL, Bayer Animal Health GmbH) će biti dodan intraperitonealno kako bi se smanjila mogućnost infekcije, a miševi će biti prebačeni u zagrijani kavez za odmor i oporavak.
Kontrola kvalitete lezije
Denervacija girusa dentatusa bit će potvrđena histokemijski na frontalnim presjecima mišjeg hipokampusa (bojenje GFAP i FluoroJade C). Bojenje FluoroJade C i imunohistokemija na glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) koristit će se za praćenje pojave produkata degeneracije i aktivacije glijalnih stanica u vanjskom molekularnom sloju. Za daljnje eksperimente ćemo koristit samo miševe čiji vanjski molekularni sloj pokazuje pozitivne histokemijske dokaze za slojevitu specifičnu denervaciju.
Testiranje ponašanja
Za procjenu promjena u ponašanju miševa nakon akutnih, subakutnih i kroničnih razdoblja nakon ECL koristit će se test labirinta otvorenog polja. Ovaj test uključuje četvrtasti prostor dimenzija 50 cm (dužina) x 50 cm (širina) x 40 cm (visina) smješten u dobro osvijetljenoj sobi. Podaci o ponašanju snimat će se kamerom montiranom na stropu (GoPro Hero 10) i naknadno analizirati pomoću video programske podrške (EthoVision XT od Noldus Information Technology). Tijekom petominutnog snimanja, zabilježit će se kretanja miševa unutar komore, uključujući specifična ponašanja kao što su samočišćenje i dizanje na stražnje noge. Osim toga, softver će omogućiti jednostavnu analizu općih lokomotornih sposobnosti (Seibenhener i Wooten, 2015). Svaka životinja biti će postavljena u isti kut prethodno dezinficirane komore za početak razdoblja istraživanja. Za procjenu dinamike promjena u prostornoj radnoj memoriji u različitim vremenskim točkama nakon ECL koristit će se spontani alternacijski T-labirint. Ispitivanje uključuje labirint u obliku slova T s tri ruke koje mjere 35 cm (dužina) x 7 cm (širina) x 40 cm (visina) i središnje područje za odabir koje mjeri 7 cm (dužina) x 7 cm (širina) x 40 cm (visina) koje povezuje ruke, smješteno u dobro osvijetljenoj sobi. Bočni zidovi labirinta biti će prozirni kako bi se miševima olakšalo prisjećanje pomoću vanjskih tragova. Svaka ruka bit će opremljena giljotinskim vratima, kako bi se spriječilo da se životinja vrati u početnu ruku i kako bi se životinje zadržale u ciljnim rukama nakon što se odluka donese. Praćenje puta snimat će se kamerom montiranom na stropu (GoPro Hero 10) i ručno analizirati video softverom (EthoVision XT od Noldus Information Technology). Bilježit će se vrijeme koje je potrebno mišu da odabere lijevu ili desnu ciljnu ruku, i nakon 30 sekundi zadržavanja u odabranoj ruci, miš će biti vraćen na krajnji kraj početne ruke. To će se ponoviti pet puta za svakog miša (d’Isa i sur., 2021). Redoslijed testiranja miševa bit će nasumičan po eksperimentalnoj grupi i redoslijedu unutar kaveza.
Perfuzija i priprema hipokampalnih kriški
SP-KO i WT grupe miševa bit će eutanazirane u određenim intervalima: 3, 7, 14 i 28 dana nakon operacije kako bi se utvrdila vremenska progresija promjena nakon lezije entorinalnog korteksa. Miševi kojima je izvedena lažna operacija služit će kao kontrola. Eutanazija će se provesti intraperitonealnom primjenom smrtonosne doze koja se sastoji od 10% ketamina (Narkamon 100mg/mL, Bioveta) i 5% ksilazina (Xylased Bio 20 mg/mL, Bioveta) u dozi od 0.2 mL/10g tjelesne težine. To će biti praćeno intrakardijalnom perfuzijom s 0.9% otopinom natrijevog klorida za ispiranje, te 4% otopinom paraformaldehida za fiksaciju. Mozgovi će brzo biti izvađeni nakon perfuzije, naknadno fiksirani 18 sati na 4°C u 4% paraformaldehidu, te zatim tri puta oprani u ledenom 0.1 M fosfatno-buferiranom otopinom. Nakon toga će biti narezani na koronalne kriške debljine 250 μm koje sadrže dorzalni hipokampus pomoću vibrirajućeg mikrotoma. Odabrani presjeci podvrgnut će se bojenju Fluoro-Jade C (Thermo Fisher) kako bi se procijenila razina entorinalne denervacije detektiranjem produkata degeneracije u vanjskom molekularnom sloju ipsilateralnog girusa dentatusa. Svi postupci strogo će se pridržavati hrvatskih propisa o zaštiti životinja uz odobrenje etičkog odbora. Učinit će se svaki napor da se minimizira stres i bol životinja.
Unutarstanične injekcije fluorescentne boje u fiksiranom tkivu
Naša istraživačka skupina je također uspješno uspostavila i testirala ovaj postupak. (Smilović i sur., 2023). Unutarstanične injekcije fluorescentne boje u hipokampalne zrnate stanice provodit će se prema sljedećem protokolu: Kriške hipokampusa bit će osigurane u prilagođenoj komori za snimanje, napunjenoj ledenim 0.1 M PBS-om. Komora će biti postavljena na epifluorescencijski mikroskop (Axioskop2 FS plus; objektiv 10x LMPlanFLN10x, NA 0.25, WD 21mm) za vizualizaciju. Oštre mikroelektrode (GB150TF-10 s filamentom, Science Products) izrađivat će se pomoću uređaja za izvlačenje mikroelektroda (PC-10 Puller, Narishige International). Te elektrode će biti napunjene na vrhu s 0.75 mM Alexa 568-Hydrazide (Invitrogen) a ostatak mikroelektrode će biti napunjen s 0.2 M kalijevim kloridom. Napunjene mikroelektrode zatim će biti povezane s iontoforetskim uređajem i precizno pozicionirane u sloj zrnatih stanica girusa dentatusa uz pomoć prilagođenog 3D isprintanog mikromanipulatora. Isporuka boje u stanicu kontrolirat će se primjenom kvadratnog napona (1 mV, 1 Hz) pomoću generatora napona (GW Instek AFG-2105). Zrnate stanice će se puniti pod izravnim vizualnim nadzorom najmanje 10 minuta ili dok se ne primijeti izostanak daljnjeg unos boje. Kriške koje sadrže uspješno napunjene stanice fiksirat će se u 4% paraformaldehidu (PFA) u PBS-u preko noći, nakon čega slijedi pranje u 0.1 M PBS-u. Za daljnju analizu, odabrat će se samo zrnate stanice s dendritima koji se protežu do hipokampalne pukotine.
Imunofluorescencija
Kriške od divljeg tipa (WT) miševa koje su ispunjene, fiksirane i narezane na 250 μm prolazit će kroz nekoliko ispiranja u 50 mM fosfatno-buferiranoj otopini (PBS) koji sadrži 0,1% Triton X-100. Te će kriške potom biti inkubirane u blokirajućoj otopini od 0,5% Triton X-100 s 5% albumina goveđeg seruma (BSA) u 50 mM PBS-u tijekom 30 minuta. Nakon toga, inkubirat će se sa sljedećim primarnim protutijelima tri dana na sobnoj temperaturi: protutijelo protiv sinaptopodina inkubirano u zamorcu (Synaptic Systems, 1 mg/ml, razrijeđeno 1:2000 u 0,1% Triton X-100 i 1% BSA u 50 mM PBS-u), protutijelo protiv Arca inkubirano u kuniću (Synaptic Systems, 1mg/ml, razrijeđeno 1:1000 u istom puferu), te protutijelo protiv gephirina inkubirano u mišu (Synaptic Systems, 1mg/ml, razrijeđeno 1:1000 u istom puferu). Nakon inkubacije s primarnim antitijelima, kriške će se tretirati odgovarajućim sekundarnim protutijelima — kozje protutijelo protiv zamorca Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1mg/ml, razrijeđeno 1:2000), kozje protutijelo protiv kunića Alexa Fluor 405 (Invitrogen, 1mg/ml, razrijeđeno 1:2000) i štakorsko protutijelo protiv miša Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1mg/ml, razrijeđeno 1:2000) — preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon toga, kriške mozga će se montirati na predmetno stakalce koristeći Vectashield sredstvo za impregniranje sa svojstvom sprječavanja blijeđenja fluorescencije (Vectorlabs). Isti protokol primijenit će se na reznice od miševa SP-KO, osim što će se koraci inkubacije koji uključuju primarno protutijelo protiv sinaptopodina i sekundarno protutijelo protiv spomenutog primarnog protutijela Alexa Fluor 488 izostaviti.
Konfokalna mikroskopija
Konfokalno snimanje provest će se na fiksnim dendritičkim segmentima iz zrnatih stanica girusa dentatusa označenih s Alexa 568 bojom, lociranih u vanjskom molekularnom sloju (OML) suprapiramidalnog djela hipokampusa. Za snimanje će se koristiti Olympus FV3000 mikroskop opremljen sa 60x uljnim objektivom za imerziju (UPlanSApo, NA 1.40, Olympus) i 5x skenirajućim povećanjem, snimajući slike rezolucije 1024 x 1024 piksela unutar ozlijeđenog hipokampusa. Označene strukture vizualizirat će se koristeći laserske linije od 405, 488, 561 i 640 nm kako bi se precizno prikazali ispunjeni segmenti i identificirale nakupine sinaptopodina, Arc-a i gephirina u kriškama WT miševa, dok se za kriške SP-KO miševa neće koristiti 488 nm laserske linije jer neće sadržavati sinaptopodin (Yap i sur., 2020). Trodimenzionalni z-zbirovi slika će se snimati s korakom od 0,15 μm duž z-osi. Da bi se osigurala dosljednost, svi parametri snimanja bit će standardizirani među uzorcima. Nakon snimanja, slike će prolaziti kroz dekonvoluciju koristeći Olympus cellSens dimensions deconvolucijski modul, koji koristi algoritam ograničene iteracije za poboljšanje jasnoće i detalja slike.
Analiza morfologije i kolokalizacije
Obrada slika i kvantitativna analiza provodit će se korištenjem softvera ImageJ (Schindelin i sur., 2012). Dendritički trnovi biti će identificirani i analizirani temeljem uspostavljenih kriterija (Holtmaat i sur., 2009), pri čemu će istraživač biti slijep za raspodjele eksperimentalnih grupa kako bi se osigurali nepristrani rezultati. Mjerenja područja glave trna i područja nakupina sinaptopodina, Arc-a i gephirina provodit će se ručnim odabirom najveće maksimalne poprečne površine vidljive u bilo kojoj od x-y ravnina unutar z-zbira slika. Ovo mjerenje koristit će unaprijed definirani prag vrijednosti sive nijanse kako bi se odredila prisutnost signala. Dodatno, dokumentirat će se podstanične lokacije nakupina—bilo da se nalaze u glavi trna, vratu trna, bazi trna ili duž dendritičkog segmenta.
Analiza pomoću računalnih alata
Računalni alati koristiti će se za projiciranje i analizu morfologije dendritičkih trnova zrnatih stanica girusa dentatusa za tri, šest i dvanaest mjeseci nakon lezije. Dinamika promjena dendritičkih trnova modelirat će se koristeći teorijski okvir razvijen od naše istraživačke skupine, s fokusom na otkrivanje matematičke formule koja obuhvaća progresiju morfoloških promjena tijekom vremena, slično našim prethodnim radovima (Yap i sur., 2020). Naša skupina prethodno je također uspostavila računalni model za analizu morfoloških promjena u dendritima zrnatih stanica unutar girusa dentatusa hipokampusa miša nakon entorinalne lezije (Platschek i sur., 2016). Planiramo poboljšati ovaj model integriranjem modeliranja u odjeljcima rekonstruiranih pojedinačnih dendritičkih trnova, koristeći TREES 1.6 alat (Cuntz i sur., 2011). Osim toga, simulacijom konstitutivne aktivnosti koristeći T2N programsku podršku (proširenje alata Trees koji pruža sučelje između Matlab-a i okruženja za kompartmentalno modeliranje NEURON, Beining i sur., 2017), cilj nam je razjasniti regulatorne mehanizme koji određuju veličine i obrasce distribucije dendritičkih trnova u zdravim i ozlijeđenim zrnatim stanicama. Ova simulacija također će uzeti u obzir ključne uloge kalcijevih i električnih odgovora u promijenjenoj dinamici trnova (Boahen i Doyon, 2020).
Statistička analiza prikupljenih podataka Statistički testovi su odabrani temeljem očekivane distribucije podataka, stoga će se koristiti neparametrijski testovi kao što su Mann-Whitneyjev test, Kolmogorov-Smirnov test, Wilcoxonov test sparivanih parova s oznakama ranga, Kruskal-Wallisov test i Friedmanov test. Nakon značajnih p-vrijednosti u testovima koji analiziraju više grupa primijenit će se Dunnov test višestrukih usporedbi. Svi statistički testovi izvodit će se korištenjem programske podrške GraphPad Prism. Ako su p-vrijednosti manje od 0,05, nultu hipotezu će se odbaciti. Statističke vrijednosti izražavat će se kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM).
Očekivani rezultati
1. Uspostava pouzdanog eksperimentalnog modela denervacije i stabilne životinjske populacije
U sklopu projekta bit će uspostavljena i održavana stabilna populacija miševa s nedostatkom sinaptopodina (SP-KO) i odgovarajućih miševa divljeg tipa (WT), uključujući uzgoj F1 i F2 generacija. Razvit će se reproducibilan model jednostrane lezije perforantnog puta kao model denervacije entorinalnog korteksa, s jasno definiranim akutnim, subakutnim i kroničnim vremenskim točkama nakon ozljede. Ovaj temeljni eksperimentalni okvir omogućit će sustavnu i usporedivu analizu strukturnih, molekularnih i funkcionalnih promjena dendritičkih trnova u kontroliranim uvjetima.
2. Kvantitativna karakterizacija vremenski ovisnih morfoloških promjena dendritičkih trnova
Projekt će rezultirati detaljnim, kvantitativnim opisom promjena u gustoći, veličini i morfologiji dendritičkih trnova zrnastih stanica dentatnog girusa u denerviranom području (vanjski molekularni sloj) kroz više vremenskih točaka nakon lezije. Konfokalnim snimanjem i 3D analizom u ImageJ-u dobit će se precizni podaci o dinamici eliminacije, remodeliranja i oporavka različitih tipova trnova (mali, srednji i veliki), uz izravnu usporedbu između SP-KO i WT miševa. Ovi rezultati omogućit će razjašnjenje uloge sinaptopodina u stabilnosti i plastičnosti dendritičkih trnova nakon ozljede.
3. Analiza sinaptičkih proteina i dvostruko inerviranih dendritičkih trnova
Projekt će pružiti sustavni uvid u lokalnu ekspresiju i kolokalizaciju ključnih sinaptičkih proteina – sinaptopodina (stabilnost), Arc-a (nedavna aktivnost) i gephyrina (inhibitorne sinapse) – unutar dendritičkih trnova tijekom oporavka od denervacije. Poseban naglasak bit će stavljen na identifikaciju i kvantifikaciju dvostruko inerviranih (gephirin-pozitivnih) trnova te njihovu ulogu u homeostatskim i kompenzatornim mehanizmima oporavka. Rezultati će omogućiti razjašnjenje molekularnih mehanizama koji povezuju strukturnu plastičnost i sinaptičku reorganizaciju nakon lezije.
4. Povezivanje morfoloških promjena s ponašajnim ishodima
Projekt će generirati integrirane podatke koji povezuju promjene u dendritičkim trnovima s ponašanjem životinja nakon lezije entorinalnog korteksa. Analizom rezultata testa otvorenog polja i testa spontane alternacije u T-labirintu, u kombinaciji s morfološkim i molekularnim parametrima, omogućit će se korelacija strukturnih promjena na razini sinapsi s funkcionalnim ishodima na razini ponašanja. Time će se dobiti dublji uvid u to kako sinaptička reorganizacija doprinosi oporavku ili trajnim promjenama kognitivnih funkcija nakon ozljede.
5. Razvoj prediktivnih računalnih modela i otvorenog repozitorija podataka Završni rezultat projekta bit će razvoj prediktivnih računalnih i kompartmentalnih modela koji integriraju eksperimentalne morfološke i molekularne podatke radi simulacije dugoročnih promjena dendritičkih trnova i aktivnosti zrnastih stanica nakon lezije. Modeli će omogućiti predviđanje dinamike sinaptičke reorganizacije do dvanaest mjeseci nakon ozljede. Paralelno će se uspostaviti visokokvalitetni, javno dostupni repozitorij morfoloških, bihevioralnih i modeliranih podataka (uključujući pohranu u repozitorij SRCE – Dabar), čime će se osigurati transparentnost, ponovljivost i dugoročna znanstvena vrijednost rezultata projekta.
Projektni tim
1. prof.dr.sc. Mario Vukšić
2. doc.dr.sc. Dinko Smilović
3. Fran Božić, dr. med.
4. Mario Zelić, dr. med.
Diseminacija i vidljivost projekta
Poster izlaganja:
1. Zelić M, Božić F, Smilović D, Vukšić M. Tempo and mode of dendritic spine morphological changes depending on synaptopodin presence in hippocampal granule cells following complete perforant pathway transection in wild-type mice. Society for Neuroscience, Neuroscience 2025. San Diego, Sjedinjene Američke Države, 14.11.2025.-20.11.2025.
2. Božić F, Zelić M, Smilović D, Vukšić M. Layer-specific changes of granule cell spines in the dentate gyrus following complete perforant pathway transection in wild-type mice. Croatian Society for Neuroscience, 10th Croatian Neuroscience Congress, 11.09.2025.-13.09.2025.
3. Zelić M, Božić F, Pospišil M, Smilović D, Vukšić M. Alterations in mouse granule cell adult neurogenesis following dentate gyrus denervation by perforant pathway transection. Croatian Society for Neuroscience, 10th Croatian Neuroscience Congress, 11.09.2025.-13.09.2025.
Usmena izlaganja:
1. Vukšić M, Božić F. Concept neurons. Hrvatska akademija znanosti i umjetnosti: simpozij "Novije spoznaje u istraživanju mozga". 13.03.2025.