Sveučilište u Zagrebu

Medicinski fakultet

Opći podaci o projektu

Naziv projekta: Sustav bioprintanog višemodularnog zgloba na čipu za procjenu odgovora na lijekove u artritisu (CHIPART)
Voditeljica projekta: prof. dr. sc. Nataša Kovačić
Ustrojbena jedinica: Katedra za anatomiju i kliničku anatomiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Partneri na projektu: IZIT d.o.o.
Trajanje projekta: od 1. studenog 2023. do 30. lipnja 2026. (32 mjeseca)
Ukupni iznos sredstava projekta: 1.643.944,59 €
Poziv i kod projekta: Ciljana znanstvena istraživanja (CZI); NPOO.C3.2.R3-I1.04.0093

Sažetak projekta

Artritisi predstavljaju važan javnozdravstveni i ekonomski problem zbog kroničnog tijeka, djelomičnog odgovora na postojeću terapiju, te rastuće prevalencije. Za istraživanje patogeneze najčešće se koriste životinjski modeli, koji često ne preslikavaju patogenezu ljudskih bolesti te nije u potpunosti uspješna njihova translacija u klinički rad.
Cilj predloženog istraživanja je uspostava potpunog modela zgloba na čipu (joint-on-a-chip) kombinacijom aditivne proizvodnje i bioprintanja ljudskih zglobnih tkiva. Time će se unaprijediti istraživanje patogeneze artritisa, ubrzati otkrivanje novih lijekova te omogućiti personalizirani pristup liječenju bolesnika.

Opis projekta

Kronične zglobne bolesti zbog starenja populacije sve su učestalije u gospodarski razvijenim zemljama, a njihovim napredovanjem se razaraju zglobna tkiva te značajno smanjuje radna sposobnost i kvaliteta života bolesnika. Složeni patogenetski mehanizmi artritisa uključuju aktivaciju imunosnih stanica koje posreduju upalne procese, razgradnju hrskavice i kosti te smanjenu obnovu zglobnih tkiva zbog smanjenog preživljenja i funkcije koštano-hrskavičnih prethodnika. Dosadašnja istraživanja unaprijedila su razumijevanje patogeneze i poboljšala liječenje artritisa. Međutim, zbog progresivnog tijeka, često neodgovarajućeg terapijskog odgovora te rastuće prevalencije, artritisi predstavljaju značajan socijalno-ekonomski problem te su potrebna preciznija istraživanja mehanizama bolesti s ciljem razvoja učinkovitijih pristupa liječenju.

Zbog složenosti međudjelovanja zglobnih odjeljaka i brojnih uključenih staničnih loza koje interakciju ostvaruju unutar krute međustanične tvari životinjski modeli su temeljni pristup istraživanju patogenetskih mehanizama artritisa, međutim dobiveni rezultati često nisu primjenjivi na ljudske bolesti zbog razlika između vrsta. Izravna analiza uzoraka (stanica i bioloških tekućina) bolesnika ograničena je količinom materijala i varijabilnošću između bolesnika. Standardni postupci ex vivo uzgoja omogućuju umnažanje ljudskih stanica, međutim kontakt stanica s ravnim plastičnim površinama dovodi do značajnih funkcijskih promjena. Dodatni nedostatak je pojednostavljeno modeliranje međudjelovanja ograničenog broja staničnih populacija, te nepostojanje tkivnog mikrookoliša, cirkulacije i trodimenzionalne strukture. Nadalje, značajnu ulogu u patogenezi imaju hematopoetske imunosne stanice (limfociti i monociti) čiju migraciju u zahvaćeni zglob nije moguće istraživati klasičnim postupcima uzgoja. Napredak biotehnologije potaknuo je razvoj mikroskopskih funkcionalnih jedinica ljudskih organa (OoC, prema engl. organ-on-chip) koje primjerenije odražavaju složeni mikrookoliš te je opisano nekoliko modela izdvojenih ili međusobno povezanih zglobnih tkiva, međutim nije uspostavljen i opisan model koji u potpunosti odražava strukturnu složenost zglobnih tkiva te migraciju i recirkulaciju stanica kroz zglobne odjeljke. Stoga je cilj projekta CHIPART razviti sustav zgloba na čipu (JoC, prema engl. joint-on-chip) koji će omogućiti modeliranje i praćenje složenih međuodnosa stanica zglobnih odjeljaka, preciznija istraživanja staničnih mehanizama ljudskih artritisa te personaliziranu procjenu odgovora stanica na lijekove u fiziološkom okruženju.

Predloženi sustav sadržavat će koštano-hrskavični odjeljak s hematopoetskim stanicama i sinovijalni odjeljak. Odjeljke će povezivati mikrocirkulacija, odnosno kapilarni prostor obloženendotelnim stanicama, što predstavlja funkcionalni model sinovijalnog zgloba. Za izradu potpore i mikrocirkulacije koristit će se aditivna proizvodnja (3D-print), koja je uz projektiranje i izradu preciznih 3D-modela područje dugogodišnje ekspertize partnera. U potporni dio precizno će se, pomoću uređaja za bioprint, rasporediti stanice s komponentama međustaničnog tkiva što predstavlja vjeran model fiziološkog mikrookoliša. Svaki odjeljak izradit će se izdvojeno, a potom će se jedinice povezati u jedinstveni organski sustav. Potvrda koncepta bit će provedena korištenjem ljudskih staničnih linija i ciljanih staničnih populacija izdvojenih iz uzoraka tkiva i/ili periferne krvi bolesnika s artritisima, odnosno uspostavom modela JoC.

Ciljevi i faze projekta

Projekt CHIPART uspostavit će sustav zgloba na čipu ostvarivanjem 3 specifična cilja:
1. Definirati materijale za izradu potpornog i mikrocirkulacijskog sustava te osnovne stanične elemente sustava
2. Razviti izdvojene modele koštano-hrskavičnog, sinovijalnog i kapilarnog odjeljka koji će se uklopiti u konačni sustav zgloba na čipu
3. Uspostaviti model artritisa na čipu, potvrditi njegovu funkcionalnost te ga testirati kao platformu za procjenu učinka lijekova.

Ostvarenje specifičnih ciljeva odvijat će se u tri faze:

Prva faza (M1-8), oblikovanje tehnološkog koncepta (TRL 2), uključuje odabir materijala za aditivnu proizvodnju potpore i mikrocirkulacije. Razmatrat će se biokompatibilni materijali tvrtke Stratasys, koji su ranije korišteni za uzgoj stanica, a potom će odabrati tehnologija aditivne proizvodnje i mehanički i/ili kemijski postupci naknadne obrade te će se proizvesti set uzoraka za daljnju analizu. U ovoj fazi će se nabaviti ljudske stanične linije različitih loza te razraditi postupci izolacije, uzgoja i karakterizacije primarnih stanica (koštano-hrskavičnih prethodnika, sinovijalnih fibroblasta, mijeloidnih stanica i limfocita).
Druga faza (M6-24) je laboratorijska potvrda funkcionalnosti aditivno proizvedenih materijala i izdvojenih odjeljaka sustava CHIPART (TRL3). Tijekom te faze usporedit će se rast staničnih linija na pločicama za kulturu s njihovim rastom na uzorcima aditivno proizvedenih materijala te odabrati konačni materijali za izradu sustava. Potom će se izraditi precizni planovi odjeljaka te će se u izrađenim pojedinačnim odjeljcima procijeniti preživljenje, prianjanje, sazrijevanje i aktivacija stanica.
Treća faza (M24-32) obuhvaća uspostavu modela upalnog artritisa na čipu (TRL3) te potvrdu njegove funkcionalnosti u laboratoriju (TRL4). Prema rezultatima faze 3 završit će se nacrt sustava te definirati izvedba granica odjeljaka. Model upalnog artritisa uspostavit će se uvođenjem upalno aktiviranih stanica u odabrani odjeljak, a pratit će se aktivnost upalnih i koštanih stanica u preostalim odjeljcima. Laboratorijska potvrda funkcionalnosti provest će se procjenom djelovanja odabranih lijekova koji se rabe za liječenje artritisa (anti-TNF-α, anti-IL1, metotreksat, bisfosfonati, inhibitori signalnog puta Wnt) u modelu artritisa na čipu.

Očekivani rezultat projekta je novi modularni pristup za izradu JoC, kombiniranjem aditivno proizvedenih materijala s postupkom bioprintanja. Modularnost sustava olakšat će prilagodbu tehnologije drugim tkivima za koja još ne postoji model OoC te osigurati širu uporabu i održivost tehnologije. Očekivano je da će uspostava modela predstavljati osnovu za povećanje razine spremnosti tehnologije za tržište.

Očekivani učinci i doprinos rezultata projekta

Oštećenje zglobnih tkiva u artritisima je rezultat upalnog razaranja hrskavice, resorpcije kosti zbog privlačenja i aktivacije osteoklasta te nedostatne regeneracije zbog oslabljene funkcije koštano-hrskavičnih prethodnika. Aktivirani limfociti stvaraju ektopično limfoidno tkivo unutar hiperplastične sinovije te proizvode citokine i kemokine, čime potiču infitraciju mijeloidnih stanica (monocita) i angiogenezu. Monociti se mogu diferencirati u upalne makrofage i dendritičke stanice koji doprinose upalnim procesima, ali i u osteoklaste koji uzrokuju koštano razaranje. Za uspješnu strategiju regeneracije nužna je karakterizacija prethodničkih stanica koje su u uvjetima upalnih artritisa slabijih funkcionalnih sposobnosti. Koštano-hrskavični prethodnici su malobrojne stanice mezenhimalne loze čija je prisutnost potvrđena u različitim tkivima, uključujući koštanu srž, masno tkivo i sinoviju. Određivanje njihovog identiteta temelj je regenerativne medicine, a minimalni kriteriji su prianjanje na plastiku, izražaj mezenhimalnih biljega, odsutnost hematopoetskih biljega  te sposobnost diferencijacije in vitro u tri loze - kost, hrskavicu i masno tkivo. Međutim, sve stanice koje zadovoljavaju navedene kriterije ne pokazuju sposobnost sazrijevanja u tri loze in vivo  te je ektopična implantacija ispod bubrežne kapsule imunokompromitiranih miševa još uvijek zlatni standard za potvrdu identiteta koštano-hrskavičnih prethodnika. Ovaj postupak ipak ne rekapitulira fiziološke/patološke zglobno-koštane niše, a povezan je i s poteškoćama u praćenju sazrijevanja stanica u stvarnom vremenu. Sve navedeno predstavlja prepreku u potvrdi identiteta i učinkovitom istraživanju koštano-hrskavičnih prethodnika, čijem će rješavanju doprinijeti tehnologija CHIPART.

Organ na čipu (OoC, prema engl. organ-on-a-chip) je biotehnološki sustav koji preslikava strukturne i funkcionalne značajke ljudskog tkiva. Prednosti modela su mali volumen i niska potrošnja kemikalija te precizni nadzor parametara uzgoja. Do danas su uspješno razvijeni modeli pluća, jetre, bubrega, srca, crijeva i kože na čipu te nekoliko modela izdvojenih ili međusobno povezanih zglobnih tkiva, ali nije uspostavljen model koji u potpunosti odražava strukturnu složenost zglobnih tkiva te migraciju i recirkulaciju stanica kroz zglobne odjeljke. Za izradu modela OoC najčešće se rabi polidimetilsiloksan (PDMS) kao potporni materijal, zbog biokompatibilnosti, prozirnosti, trajnosti i fiziološke inertnosti. PDMS se najčešće oblikuje litografijom, čija su ograničenja nedostatak preciznosti i potreba za izradom novog kalupa pri modifikaciji sustava. Stoga se sve više istražuju mogućnosti tehnologije aditivne proizvodnje za pripremu OoC, a osim PDMS-a potvrđena je i biokompatibilnost komercijalnih materijala s dodatnom mogućnošću izrade preciznih gradijenta tvrdoće, važnih za rekapitulaciju morfologije koštano-zglobnog sustava.

Očekivani učinci i doprinos rezultata predloženog istraživanja

Unaprjeđenje metodologije istraživanja artritisa: Tehnologija CHIPART doprinijet će razvoju učinkovitijeg istraživanja mehanizama artritisa u fiziološki/patološki relevantnijem okruženju, ubrzat će otkrivanje novih posrednika bolesti, a time i novih lijekova koji dugoročno mogu unaprijediti prognozu bolesnika.

Unaprjeđenje metodologije OoC: Projekt CHIPART definirat će nove materijale primjerene za aditivnu proizvodnju OoC, čija je uporaba do sada prikazana jedino u postupcima dvodimenzionalne kulture. Ovakav pristup omogućit će izravnu, nelitografsku izradu OoC, brzu promjenu specifikacija sustava te prilagodbu potpornih komponenata.

Unaprjeđenje istraživanja funkcije koštano-hrskavičnih prethodnika: Razvojem bioprintanih zglobnih odjeljaka precizno će se oblikovati fiziološke niše u kojima će se moći pratiti sazrijevanje i odrediti identitet populacija koštano-hrskavičnih prethodnika te pratiti učinak imunosnih stanica na funkciju koštano-hrskavičnih prethodnika.

Unaprjeđenje terapije: Razvojem tehnologije prema višim razinama tehnološke spremnosti (TRL5-9) projekt će doprinijeti bržoj provjeri djelotvornosti novootkrivenih lijekova i razvoju personaliziranih postupaka liječenja. Zbog varijabilnosti između bolesnika, lijekovi koji se primjenjuju nisu u svih jednako učinkoviti. Visokorazvijena tehnologija CHIPART moći će se koristiti pri odabiru optimalne strategije liječenja preciznom analizom terapijskog odgovora stanica periferne krvi ili stanica izdvojenih iz sinovijalnog odjeljka.

Prednosti tehnologije CHIPART u odnosu na postojeće stanje su:

1. Zglob na čipu (JoC) će, za razliku od do sada opisanih modela, omogućiti uspostavljanje složene strukture svih zglobnih odjeljaka te praćenje migracije i recirkulacije stanica kroz odjeljke,
2. Postupak izravne aditivne proizvodnje strukturne potpore zglobnim odjeljcima bit će razrađen na način da omogući brzu i preciznu izradu i prilagodbu karakteristika sustava (dimenzija, broj komora, tvrdoća materijala, ustroj mikrocirkulacije), što je prednost u odnosu na litografiju,
3. Integracija postupka bioprintanja zglobnih tkiva omogućit će precizno preslikavanje morfološke organizacije ljudskog sinovijalnog, koštanog i hrskavičnog tkiva i fiziološki mikrookoliš, što je prednost u odnosu na uvođenje stanica suspendiranih u mediju u sustav. Postupak se također može brzo prilagoditi zahtjevima drugih tkiva i na taj način proširiti područje analize,
4. Tehnologija će omogućiti praćenje diferencijacije i potvrdu identiteta koštano-hrskavičnih prethodničkih stanica u fiziološkom mikrookolišu, što je trenutno moguće samo primjenom modela implantacije stanica pod bubrežnu ovojnicu imunokompromitiranih miševa.

Izravne ciljne skupine na koje će projekt utjecati tijekom provedbe su istraživači i tvrtke koje proizvode istraživačku i dijagnostičku opremu. Dostupnost tehnologije povećat će kvalitetu istraživanja, ojačati suradnju, doprinijeti zamjeni („replacement“) životinjskih modela i smanjiti visoke troškove korištenja životinja. Tvrtke će u suradnji s prijaviteljem i partnerom razvijati sustave za procjenu djelovanja lijekova u artritisima i drugim kroničnim bolestima, čime će se proširiti njihova ponuda i povećati tržišni doseg te omogućiti njihovo uključenje u buduće projekte razvoja tehnologija (IRI, EIC). Dugoročnu korist nakon završetka projekta imat će liječnici kojima će tehnologija omogućiti predviđanje odgovora na liječenje ili planiranje kliničkih studija, i pacijenti zbog poboljšane prevencije i liječenja artritisa te unaprijeđene kvalitete života.

Projektni tim

Voditeljica projekta: prof. dr. sc. Nataša Kovačić
Pomoćnik voditeljice: doc. dr. sc. Alan Šućur
Projektna administratorica prijavitelja: Ivana Šiprak, mag. oec.
Vanjski stručnjak za upravljanje projektom i nabavu

Istraživački tim Medicinskog fakulteta (MEF) sastoji se od 6 istraživača Laboratorija za molekularnu imunologiju (MOLIM) i 3 klinička istraživača.

Istraživački tim Laboratorija MOLIM:
prof. dr. sc. Nataša Kovačić
doc. dr. sc. Alan Šućur
prof. dr. sc. Danka Grčević
prof. dr. sc. Tomislav Kelava
prof. dr. sc. Vedran Katavić
dr. sc. Maša Filipović

Klinički istraživači Medicinskog fakulteta:
prof. dr. sc. Mislav Jelić
prof. dr. sc. Porin Perić
dr. sc. Marina Ikić-Matijašević

Istraživački tim Partnera (IZIT d.o.o.):
dipl. ing. Amir Šećerkadić
Marko Zajec, mag. ing.
Marko Perić, mag. ing.
Luka Naglić, dipl. ing.

Članovi tima – vanjski suradnici
dr. sc. Vesna Kokondoska Grgič, stručnjakinja za bioprintanje zaposlena u tvrtki Kemomed d.o.o. Ljubljana, Slovenija
prof. dr. sc. Zdravko Schauperl, stručnjak za karakterizaciju aditivno proizvedenih materijala zaposlen na Fakultetu strojarstva i brodogradnje Sveučilišta u Zagrebu (FSB)

Aktivnosti projekta

A.1. INDUSTRIJSKO ISTRAŽIVANJE – FAZA 1 (Formuliranje tehnološkog koncepta – TRL 2)

• A1.1. (M1-3) Odabrati materijale koji će se koristiti za izradu potpornog i mikrocirkulacijskog sustava i postupke njihove naknadne obrade
• A1.2. (M1-6) – Odabrati i uspostaviti stanične linije, definirati populacije primarnih stanica, razraditi protokole njihove izolacije, uzgoja, diferencijacije i procjene funkcije
• A1.3. (M 3-8) – Pripremiti uzorke aditivno proizvedenih materijala tretiranih različitim postupcima naknadne obrade
  
  Rezultati:
  
• Odabrani materijali koji će se koristiti za izradu potpornog i mikrocirkulacijskog sustava i postupci naknadne obrade
• Definirani uvjeti uzgoja staničnih linija i populacija primarnih ljudskih stanica
• Pripremljeni materijali za provjeru interakcija sa stanicama

A.2. INDUSTRIJSKO ISTRAŽIVANJE – FAZA 2 (Pokusni dokaz koncepta – TRL3)

• A2.1. (M 6-12) – Procijeniti karakteristike stanica uzgajanih na aditivno proizvedenim materijalima
• A2.2. (M6-20) Uhodati model bioprintanog sinovijalnog i hrskavično-koštanog tkiva
• A2.3 (M 12-20) Razraditi konstrukciju čipa  i komponente mikrocirkulacijskog sustava
  
  Rezultati:
  
• Procijenjene karakteristike stanica uzgajanih na aditivno proizvedenim materijalima
• Članovi tima educirani za bioprint
• Uhodani modeli bioprintanog sinovijalnog i koštano-hrskavičnog tkiva
• Definirana konstrukcija sustava
• Procijenjeno preživljenje i aktivnost stanica uzgajanih u izdvojenim odjeljcima

A.3. INDUSTRIJSKO ISTRAŽIVANJE – FAZA 3 (Tehnologija dokazana u laboratoriju – TRL4)

• A.3.1. (M 25-28) Uspostaviti postupak uzgoja stanica u potpunom sustavu modela zgloba na čipu (JoC, prema engl. joint-on-chip) prototipa CHIPART
• A.3.2. (M29-32) Uspostaviti model artritisa na čipu i potvrditi funkcionalnost prototipa CHIPART
• A 3.3. (M24-32) Priprema projektnih prijedloga za buduće financiranje i planiranje dugoročne suradnje između MEF-a i gospodarstva
  
  Rezultati:
• Procijenjene karakteristike stanica uzgajanih u sustavu CHIPART
• Uhodan model artritisa na čipu
• Potvrđena inhibicija koštane/hrskavične resorpcije uvođenjem protuupalnog/anaboličkog/antiresorptivnog lijeka

A.4. NABAVA ISTRAŽIVAČKE OPREME I UREĐAJA

U okviru projekta planirana je nabava razvrstavača stanica s četiri lasera i mogućnošću razdvajanja na temelju najmanje 12 parametara, bioprintera i mikrocirkulacijskog sustava, kabineta s laminarnim protokom zraka, te hladnjaka -80°C. Nabavom planirane opreme bit će stvorene tehničke pretpostavke za provedbu vrhunskih projekata u području regenerativne medicine, imunologije, reumatologije, ortopedije, primijenjenih istraživanja razvoja novih lijekova i modeliranja ljudskih bolesti na čipu.  Ukupna vrijednost ulaganja iznosi 755.000,00 €.

A.5. ZAŠTITA INTELEKTUALNOG VLASNIŠTVA

Aktivnost zaštite intelektualnog vlasništva obuhvaća izradu Studije provjere i zaštite intelektualnog vlasništva nad rezultatima projekta i Studije isplativosti, uspostavu suradnje sa zainteresiranim tvrtkama kroz organizaciju radionica za poticanje prijenosa tehnologije te prijavu patenta.

A.6. DISEMINACIJA REZULTATA ISTRAŽIVANJA

U okviru aktivnosti Diseminacije rezultata istraživanja planirane su objava znanstvenih članaka i sudjelovanje na znanstvenim i stručnim skupovima. Projektni tim će objaviti svoje rezultate u časopisima s velikim utjecajem u području reumatologije, imunologije i biomaterijala. Planira se objava barem jednog članka za vrijeme trajanja projekta, a ostalih do dvije godine nakon završetka projekta. Planira se i sudjelovanje na relevantnim nacionalnim i međunarodnim konferencijama i događajima, kao što su kongres Europskog društva za kalcificirana tkiva (ECTS), Međunarodnog društva za regeneraciju hrskavice i očuvanje zglobova (ICRS), Međunarodna konferencija o biotisku (ICB) i Konferencija europskog društva za organe na čipu (EUROoCS). Partner planira predstaviti tehnologiju na industrijskim sajmovima, primjerice Formnext Expo i TCT 3Sixty. Planira se predstavljanje rezultata na jedan do dva događaja godišnje (2 istraživača).

A.7. UPRAVLJANJE PROJEKTOM

Administrativno i financijsko upravljanje projektom preuzet će Projektni tim (voditeljica, pomoćnik voditeljice, projektna administratorica, vanjski stručnjak za upravljanje), koji će uspostaviti učinkovitu suradnju između prijavitelja i partnera, organizirati sastanke konzorcija (kvartalno, godišnje), koordinirati i pripremati izvješća. Za znanstveno upravljanje i periodično izvješćivanje razradit će se detaljni tehnički plan provedbe s ciljem osiguranja kvalitete svih rezultata. Na početku projekta pripremit će se Plan komunikacije i diseminacije i Plan upravljanja intelektualnim vlasništvom.

A.8. KOMUNIKACIJA I VIDLJIVOST

Planirana je izrada web stranice, izrada promotivnih materijala vezanih uz organizaciju događaja, sudjelovanje u radionicama za javnost (Festival znanosti, sajmovi inovacija). Na nabavljenu opremu postavit će se oznake vidljivosti u skladu s uputama provedbenog tijela.