Sveučilište u Zagrebu

Medicinski fakultet

Opći podaci o projektu

Naziv projekta: Oštećenje DNA i diferencijacija akutne mijeloične leukemije (DD&D_in_AML)
Voditeljica projekta: prof. dr. sc. Dora Višnjić
Ustrojbena jedinica: Katedra za fiziologiju i imunologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 18. prosinca 2023. do 17. prosinca 2027. (48 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 196.820,00 €
Poziv i kod projekta: Istraživački projekti (IP); IP-2022-10-9146

Sažetak projekta

Glavno obilježje akutne mijeloične leukemije (AML) je izostanak diferencijacije pa je stoga poticanje diferencijacije izgledni pristup liječenju. Najuspješniji primjer diferencirajućeg liječenja je liječenje akutne promijelocitne leukemije (APL) pomoću sve­trans retinske kiseline (ATRA). Nedavni uspjeh inhibitora mutirane izocitrat-dehidrogenaze obnovio je zanimanje za diferencirajuće liječenje, a učinci inhibitora dihidroorotat­dehidrogenaze (DHODH) se aktivno istražuju. Naša istraživačka skupina ima dugogodišnje iskustvo u istraživanju mehanizama diferencijacije leukemija. Naša nedavna istraživanja otkrila su da 5-aminoimidazol-4-karboksiamid ribonukleozid (AIKAr) potiče diferencijaciju monocitnih linija AML te podskupine primarnih blasta izoliranih iz koštane srži (KS) oboljelih od AML. AIKAr koči sintezu pirimidina nizvodno od DHODH i potiče diferencijaciju aktivacijom kinaze Chk1 i signalnoga puta oštećenja DNK, a isti se put aktivira i tijekom diferencijacije potaknute citarabinom, uobičajenim citotoksičnom lijekom. Različiti čimbenici in vivo doprinose izostanku translacije pretkliničkih otkrića u uspješno kliničko liječenje, kao što su učinci mikrookoliša KS, relaps bolesti i manjak prediktivnih molekularnih markera u oboljelih. U ovome projektu planiramo odrediti učinke strome KS na diferencijaciju AML, odrediti poremećaje nukleotida koji potiču put oštećenja DNK te nizvodne ciljeve aktivirane Chk1, uspostaviti model blasta AML ex vivo koji će bolje probirati oboljele koji odgovaraju na diferencirajuće liječenje te sekvencioniranjem uzoraka primarnih blasta odrediti biomarkere osjetljivosti na lijekove. U konačnici, razvit ćemo mišji model koji omogućava testiranje učinaka lijekova in vivo. Ovaj projekt okuplja stručnjake u područjima kliničke i eksperimentalne hematologije kako bi odredih mehanizme diferencijacije AML te razvili modele i alate koji mogu pomoći probiru oboljelih od AML koji odgovaraju na diferencirajuće liječenje.

Ciljevi projekta

Specifični ciljevi projekta:
1. Istražiti učinke diferencijacijskih tvari u modelu kokulture strome i AML-a;
2. Ispitati fenotip i funkciju stanica AML-a tretiranih diferencijacijskim tvarima te testirati reverzibilnost diferencijacije i zastoja u staničnom ciklusu;
3. Ispitati metaboličke promjene izazvane AIKAr-om i inhibitorom DHODH-a;
4. Istražiti nizvodne ciljeve aktiviranog Chk1 koji posreduju u diferencijaciji;
5. Razviti i unaprijediti model kokulture koji bi omogućio bolju proliferaciju i preživljavanje primarnih AML blasta in vitro;
6. Identificirati podskupine oboljelih od AML-a koji su osjetljivi na diferencijaciju posredovanu lijekovima.C7. Ispitati učinke AIKAr-a u modelu ksenografta ljudske AML stanične linije u mišjem modelu in vivo.

Metodologija istraživanja

U ovome projektu ćemo stvoriti modele koji će nam omogućiti određivanje učinaka strome koštane srži na diferencijaciju AML u odgovoru na AIKAr i ostale diferencirajuće tvari. Učinci prisutnosti stromalnih stanica na diferencijaciju AML potaknutu AIKAr-om, inhibitorima DHODH i malim koncentracijama citarabina (LDAC, eng. Low dose AraC) te učinci tvari na same stromalne stanice istraživat će se u sustavu kokultivacije stromaInih i stanica AML uporabom protočne citometrije i morfološke analize. Provest ćemo opsežnu fenotipsku i funkcionalnu analizu stanica koje su diferencirane u nazočnosti inhibitora pirimidinske sinteze kako bismo razlikovali diferencijaciju i senescenciju te kako bismo testirali mogućnost reverzibilnosti fenotipskih promjena u odsutnosti agonista. Definirat ćemo metaboličke promjene potaknute AIKAr-om, identificirati poremećaje nukleotida koji aktiviraju signalni put oštećenja DNA. Provest će se LC/MS/MS-analiza metabolita purina i pirimidina u stanicama AML koje su tretirane AIKAr-om te usporediti s učincima inhibitora DHODH. Istražit ćemo ulogu glutamina i reaktivnih oblika kisika u diferencijaciji. Pomoću genskih analiza, metode western blot, farmakoloških inhibitora i transfekcije siRNA definirat ćemo nizvodne ciljeve koji povezuju aktivaciju kinaze Chk1 i diferencijaciju stanica AML, posebice ulogu kinaze Wee1 i p21. Dodatno, razvit ćemo modele koji omogućuju bolju proliferaciju primarnih blasta AML ex vivo. Planiramo uspostaviti in vitro model za određivanje diferencijacije uporabom kokultivacije primarnih blasta i stromalnlh staničnih linija ili primarnih stromalnih fibroblasta koštane srži. Očekujemo da će veća proliferacija olakšati probir onih uzoraka koji diferenciraju u odgovoru na inhibitore sinteze pirimidina. Kako bismo odredili podskupinu oboljelih od AML koji su osjetljivi na diferencijaciju potaknutu lijekovima in vitro, moramo prikupiti veliku kohortu kliničkih uzoraka. Provest ćemo sljedeću generaciju sekvenciranja primarnih uzoraka.

Očekivani rezultati

Očekujemo da će ove studije odrediti molekularne abnormalnosti koje se mogu koristiti kao prediktivni i pouzdani biomarkeri osjetljivosti na lijekove i tako identificirati oboljele koji bi mogli imati korist od diferencirajućeg liječenja s AIKAr­ om, inhibltorima DHODH i LDAC. U konačnici predlažemo uspostavu modela ksenografta stanične linije AML u miša NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, NGS koji će nam omogućiti testiranie učinaka lijekova in vivo.

Projektni tim

prof. dr. sc. Dora Višnjić
prof. dr. sc. Radovan Vrhovac
prof. dr. sc. Drago Batinić
doc. dr. sc. Hrvoje Lalić
doc. dr. sc. Vilma Dembitz
doc. dr. sc. Josip Batinić
prof. dr. sc. Antonio Bedalov
dr. sc. Tomislav Smoljo
Alojzija Brčić, dr. med.

Diseminacija i vidljivost

Publikacije

1. Smoljo T, Lalic H, Dembitz V, Tomic B, Batinic J, Vrhovac R, Bedalov A, Visnjic D. Bone marrow stromal cells enhance differentiation of acute myeloid leukemia induced by pyrimidine synthesis inhibitors. Am J Physiol Cell Physiol. 2024 Nov 1;327(5):C1202-C1218. doi: 10.1152/ajpcell.00413.2024. Epub 2024 Sep 16. PMID: 39279497. Bone marrow stromal cells enhance differentiation of acute myeloid leukemia induced by pyrimidine synthesis inhibitors | American Journal of Physiology-Cell Physiology
   
   
2. Smoljo T, Tomic B, Lalic H, Dembitz V, Batinic J, Bedalov A, Visnjic D. Bone marrow stromal cells reduce low-dose cytarabine-induced differentiation of acute myeloid leukemia. Front Pharmacol. 2023 Oct 26;14:1258151. doi: 10.3389/fphar.2023.1258151. PMID: 37954840; PMCID: PMC10637411. Frontiers | Bone marrow stromal cells reduce low-dose cytarabine-induced differentiation of acute myeloid leukemia

Kongresi

Obranjen doktorski rad

Tomislav Smoljo. Mehanizam diferencijacije stanica akutne mijeloične leukemije potaknute citarabinom., 2024