Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Rekonstitucija fiziološkog gangliozidnog sastava membrane u neuronalnim staničnim linijama (GANGLIO-RECON)
Naziv projekta na engleskom jeziku: Reconstitution of the physiological ganglioside membrane composition in neuronal cell lines (GANGLIO-RECON)
Voditelj projekta: izv. prof. dr. sc. Kristina Mlinac Jerković
Ustrojbena jedinica: Zavod za kemiju i biokemiju i Hrvatski institut za istraživanje mozga (HIIM)
Partneri na projektu: Department of Neuroimaging, BRAIN Centre, King’s College London, UK; Department of Pharmacology and Molecular Sciences i Department of Neuroscience, School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, SAD; National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
Trajanje projekta: od 27. studenog 2024. do 26. studenog 2026. (48 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 156.109,00 €
Izvor financiranja: Nacionalni plan oporavka i otpornosti (NPOO); Institucionalni projekti (10106-25-2977)
Opis projekta
| Gangliozidi su membranski glikosfingolipidi koji predstavljaju dominantne odrednice glikoma mozga. Urođeni poremećaji glikozilacije gangliozida uključuju nekoliko teških ljudskih bolesti, primjerice epileptički sindrom s početkom u dječjoj dobi, nasljednu spastičnu paraplegiju i sindrom West. Biokemijski fenotip svih ovih poremećaja karakterizira promijenjen gangliozidni sastav staničnih membrana u živčanom sustavu. Od ključne važnosti za rasvjetljavanje složene kliničke slike urođenih poremećaja glikozilacije gangliozida u ljudi je provođenje ciljanih istraživanja s translacijskim potencijalom kako bi se razjasnila patološka kaskada koja dovodi do bolesti i razvili novi pristupi liječenju. Stoga u okviru ovog projekta planiramo uspostaviti in vitro sustav kojim ćemo u staničnu membranu neuronalnih staničnih linija uvesti bioortogonalne gangliozide priređene klik-kemijom. U prvoj fazi projekta priredit ćemo bioortogonalne gangliozide u komercijalnoj ljudskoj neuroblastomskoj staničnoj liniji. U drugoj fazi projekta namjeravamo bioortogonalne gangliozide obilježene specifičnim fluoroforima, koji se ponašaju kao analogni fiziološki gangliozidi, uvesti u stanične kulture s promijenjenim sastavom gangliozida. Opisani eksperimentalni postupci omogućit će ne samo rekonstituciju fiziološkog sastava stanične membrane nego i praćenje ugrađivanja gangliozida u membranu te njihovih ključnih interakcija u stvarnom vremenu. Istraživanje uključuje interdisciplinarni i inovativni pristup, primjenom moderne tehnike klik-kemije udružene s molekularno-biološkim i biokemijskim metodama u svrhu rasvjetljavanja patofiziologije urođenih poremećaja glikozilacije gangliozida i pronalaženja novih smjerova liječenja. |
Ciljevi projekta
Opći cilj: Rekonstitucija fiziološkog sastava gangliozida neuronalne membrane u stanicama s promijenjenim sastavom membrane, odnosno stanicama koje ne eksprimiraju složene gangliozidne vrste.
Specifični ciljevi:
1. Razviti sustav priređivanja bioortogonalnih gangliozida metodama klik-kemije u neuronalnim staničnim kulturama.
2. Pratiti dinamiku ugrađivanja bioortogonalnih gangliozida u staničnu membranu i izolirati sintetizirane bioortogonalne gangliozide.
3. Usporediti ugradnju bioortogonalnih gangliozida s egzogeno dodanim gangliozidima (fluorescentno obilježeni i neobilježeni gangliozidi).
4. Rekonstituirati fiziološki sastav stanične membrane u staničnim linijama s nedostatkom GM3-sintaze koje posljedično ne eksprimiraju složene gangliozide, kao što je slučaj kod pacijenata s epileptičkim sindromom s početkom u dječjoj dobi.
5. Analizirati interakcije između gangliozida i odabranih proteina u modelnoj membrani primjenom računalnih metoda simulacije molekulske dinamike.
Metodologija projektnog istraživanja
Stanične kulture ljudske neuroblastomske stanične linije SH-SY5Y uzgajat će se u skladu s uputama proizvođača. Bioortogonalni gangliozidi pripremit će se reakcijama klik-kemije između ciklooktina i azida uz nastajanje triazola, čime će se dobiti fluorescentni gangliozidi ugrađeni u staničnu membranu. Porast fluorescencije u staničnoj kulturi kontinuirano će se pratiti pomoću uređaja za vizualizaciju fluorescentno obilježenih stanica (Fluorescent Cell Imager). Novosintetizirani fluorescentno obilježeni gangliozidi izolirat će se iz uzgojenih neuroblastomskih stanica te analizirati kromatografijom visoke sposobnosti razlučivanja (HPTLC) uz vizualizaciju rezorcinol–HCl reagensom, immunoblotom te spektrometrijom masa (MS i MS/MS). Izolirani gangliozidi koristit će se za rekonstituciju staničnih membrana stanica s deficijentnim genom za glikoziltransferazu uključenu u put biosinteze gangliozida. Stanice će se tretirati egzogeno dodanim gangliozidima, a ugradnja klasičnih fluorescentno obilježenih gangliozida usporedit će se s ugradnjom bioortogonalnih gangliozida. Usporedba će se provesti vizualizacijom fluorescentno obilježenih stanica, staničnih membrana, odabranih proteina i gangliozida konfokalnom mikroskopijom te u završnoj točki imunocitokemijskom analizom. Uz praćenje porasta fluorescencije stanične membrane, usporedit će se ekspresija ključnih membranskih proteina ovisnih o specifičnom gangliozidnom okolišu, Na⁺/K⁺-ATPaze (NKA) i Ca²⁺-ATPaze stanične membrane (PMCA), u kontrolnim i rekonstituiranim staničnim linijama. Ekspresija proteina analizirat će se Western blot metodom uz detekciju ECL reagensom i vizualizaciju signala pomoću BioRad ChemiDoc MP imagera, a dodatno će se kvantificirati In-Cell Western tehnologijom (ICW). Računalne tehnike molekulske dinamike koristit će se u svrhu analize interakcija između gangliozida i odabranih proteina u modelnoj membrani, kao nadgradnja laboratorijskih metoda koje će omogućiti dublji uvid u interakcije gangliozida unutar membrane.
Očekivani rezultati
1. Omogućavanje ne samo puke rekonstitucije fiziološkog sastava gangliozida stanične membrane, nego i praćenje ugrađivanja gangliozida u membranu te njihovih ključnih interakcija u stvarnom vremenu, u svrhu stvaranja temelja za translaciju rezultata u potencijalne terapije urođenih poremećaja glikozilacije gangliozida, kao i sličnih poremećaja uzrokovanih aberantnom glikozilacijom
2. Detaljno mapiranje interakcije gangliozida s ostalim komponentama membrane, što je ključan prvi korak za rasvjetljavanje kliničke slike urođenih poremećaja glikozilacije gangliozida, kao i za razvoj novih smjerova liječenja ovih poremećaja.
3. Metodologije razvijene tijekom provedbe projekta, osobito sinteza i primjena bioortogonalnih gangliozida u živim staničnim kulturama, ostat će trajna praksa Laboratorija za molekularnu neurobiologiju i neurokemiju, Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Projektni rezultati služit će kao osnova za prijave novih istraživačkih projekata u okviru natječaja Hrvatske zaklade za znanost te međunarodnih programa.
Projektni tim
Popis osoba projektnog tima s Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu:
1. izv. prof. dr. sc. Kristina Mlinac Jerković
2. prof. dr. sc. Svjetlana Kalanj Bognar
3. Eva Josić, mag. chem.
Popis osoba projektnog tima partnera:
1. dr. sc. Katarina Ilić, Department of Neuroimaging, BRAIN Centre, King’s College London, UK
2. prof. dr. sc. Ronald L. Schnaar, Department of Pharmacology and Molecular Sciences i Department of Neuroscience, School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, SAD
3. prof. dr. sc. Alina D. Zamfir, National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
4. dr. sc. Mirela Sarbu. National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
5. dr. sc. Raluca Ica, National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
Diseminacija i vidljivost projekta
Vidljivost projekta osigurat će se objavom znanstvenih publikacija u domaćim i međunarodnim časopisima te sudjelovanjem članova projektnog tima na relevantnim znanstvenim konferencijama. Planirane su i dodatne diseminacijske aktivnosti putem društvenih mreža (Linkedin, X, Facebook, Instagram) i institucijskih stranica, budući da smatramo kako komunikacija sa znanstvenom zajednicom i širom javnosti uvelike doprinosi ne samo popularizaciji znanosti u široj javnosti već i dugoročno većem ulaganju i financijskoj potpori znanstveno-istraživačkih projekata.