Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Napredni glikomimetici za liječenje neurodegenerativnih poremećaja povezanih sa starenjem: Složeno biološko istraživanje
Naziv projekta na engleskom jeziku: Advanced Glycomimetics for the Treatment of Age-Related Neurodegenerative Disorders: A Complex Biological Exploration
Akronim projekta: GlycoDrug
Koordinator projekta: Institut za mikrobiologiju Češke akademije znanosti, prof. Ing. Vladimír Křen, DrSc., FRSC
Voditelj projekta MF: prof. dr. sc. Dinko Mitrečić, dr. med.
Ustrojbena jedinica voditelja projekta MF: Zavod za histologiju i embriologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Partneri na projektu: Institut za eksperimentalnu medicinu Češke akademije znanosti
Trajanje projekta: od 1. travnja 2024. do 31. ožujka 2028. (36 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 197.000,00 €
Izvor financiranja: Hrvatska zaklada za znanost (HRZZ)
Projektni tim
Projektni tim MF:
1. prof. dr. sc. Dinko Mitrečić, dr. med.
2. izv. prof. dr. sc. Marina Radmilović
3. doc. dr. sc. Anton Glasnović, dr. med.
4. dr. sc. Jure Krasić
5. Iva Šimunić, dr. med.
6. Sandra Grgić
7. dr. sc. Ana Bekavac
8. dr. sc. Paula Stančin
Projektni tim partnera:
1. doc. dr. sc. Ivan Alić, dr. med. vet.
2. Ante Plećaš, dr. med. vet.
3. Sandra Kunštek, mag. ing. biotechn.
4. prof. dr. sc. Vladimír Křen, dipl. ing.
5. izv. prof. dr. sc. Pavla Jendelová
6. dr. sc. Karolína Turnovcová, dr. med.
7. Noelia Martinéz
8. Sely Papan
9. dr. sc. Dana Mareková
10. Šárka Michálková
Opis projekta
Alzheimerova bolest (AD) predstavlja veliki izazov za zdravstvo i socio-ekonomski krajolik. Selektivna inhibicija O-GlcNAc-aze dovodi do povećanja O-GlcNAc-modificiranog Tau proteina, čime se smanjuje njegova hiperfosforilacija i ublažava neurodegeneracija. Hrvatsko-češki projekt ima za cilj sveobuhvatnu evaluaciju novo dizajniranih peteročlanih karbacikličkih osnovnih struktura, proizašlih iz nedavne suradnje, putem rigoroznih bioloških ispitivanja te optimizaciju ove osnovne strukture. Evaluacije će obuhvatiti napredne in vitro i in vivo studije kako bi se procijenila učinkovitost u ublažavanju neurodegeneracije i unaprijedile strukturne karakteristike za optimalna farmakološka svojstva. Ovi glikofarmaci bit će testirani na sposobnost prolaska kroz krvno-moždanu barijeru (BBB), inhibiciju OGA, pojačavanje O-GlcNAcilacije te smanjenje fosforilacije Tau proteina i neurodegeneracije u naprednim biološkim modelima. Ispitivanja će uključivati statičke i dinamičke modele BBB-a, procjenu inhibicije fosforilacije Tau proteina u ljudskom AD modelu pomoću cerebralnih organoida te istraživanje učinkovitosti u in vivo tauopatskom mišjem modelu.
Ciljevi projekta
Opći cilj: Optimizacija i procjena novih selektivnih inhibitora humane beta-glukozaminidaze za liječenje neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih tauopatijama.
Specifični ciljevi:
1. Evaluirati nove inhibitore na vitalnim staničnim parametrima (preživljenje, morfologija, povezanost) na normalnim ljudskim neuronima uzgojenima in vitro te testirati potencijalnu citotoksičnost spojeva.
2. Testirati učinkovitost novog OGA inhibitora u poticanju O-GlcNAcilacije na 2D i 3D ljudskim in vitro modelima Alzheimerove bolesti.
3. Ispitati učinkovitost novih OGA inhibitora u inhibiciji fosforilacije Tau proteina, smanjenju njegove akumulacije i poboljšanju preživljenja stanica u modelu ljudskih moždanih organoida za Alzheimerovu bolest.
4. Kvantificirati učinkovitost Cyclapent E u zaštiti od neurodegeneracije u P301S mišjem modelu Alzheimerove bolesti.
Metodologija projektnog istraživanja
Uzgoj iPSCs, NSC te cerebralnih organoida
Inducirane pluripotentne matične stanice (iPSCs) diferencirat će se u neuralne matične stanice (NSC) ili u cerebralne organoide (CO) kako bi se dobili složeni trodimenzionalni modeli mozga. Ovi modeli omogućit će proučavanje patoloških mehanizama Alzheimerove bolesti i ispitivanje učinaka Cyclapent E.
Imunohistokemija (IHC) i imunocitokemija (ICC)
Stanice i CO bit će tretirani različitim uvjetima, nakon čega će se imunohistokemijski (IHC) i imunocitokemijski (ICC) obraditi da se omogući vizualizacija morfoloških promjena i izraženosti specifičnih proteina povezanih s neurodegeneracijom.
Konfokalna mikroskopija
Obojene stanice i CO bit će slikani konfokalnim mikroskopom kako bi se kvantificirale razina neurodegeneracije. Ova metoda omogućuje visoku prostornu rezoluciju i preciznu analizu patoloških promjena.
Light-sheet mikroskopija za kvantifikaciju akumulacije i organizacije Tau proteina i ostalih markere neurodegeneracije u prosvjetljenim organoidima
Transparentni organoidi tretirani metodama prosvjetljivanje tkiva analizirat će se pomoću light-sheet mikroskopije kako bi se dobila trodimenzionalna vizualizacija akumulacije i prostorne organizacije Tau proteina i ostalih markera neurodegeneracije unutar strukture organoida.
Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) za analizu specifične intracelularne lokalizacije Tau proteina
Uzorci će se analizirati pomoću TEM-a kako bi se s visokom rezolucijom vizualizirala subćelijska lokalizacija Tau proteina. Ova metoda omogućuje proučavanje agregata proteina na ultrastrukturnoj razini.
Korištenje softvera IMARIS 9.9.1 za analizu trodimenzionalnih slika
Softver IMARIS 9.9.1 koristit će se za kvantitativnu analizu konfokalnih i light-sheet mikroskopskih podataka. Omogućit će segmentaciju, praćenje i kvantifikaciju proteinskih agregata te njihovu distribuciju unutar organoida.
Procjena raznih markera neurodegeneracije pomoću Western blot (WB), ELISA i qPCR analiza
Razine ekspresija ključnih proteina povezanih s neurodegeneracijom mjerit će se u prethodno definiranim vremenskim točkama pomoću Western blot (WB) analize, kvantitativnog PCR-a (qPCR) i ELISA metode. Ove analize omogućit će kvantifikaciju promjena u fosforilaciji Tau proteina na razini proteina i transkripta, čime će se precizno procijeniti učinak inhibitora.
Analiza sekretoma stanica pomoću WB i ELISA metoda
Sekretorne molekule oslobođene iz tretiranih stanica u medij analizirat će se kako bi se utvrdile promjene u izlučivanju protuupalnih i upalnih faktora te drugih biomarkera neurodegeneracije.
P301S mišji model tauopatije
Studije na P301S transgeničkim miševima koristit će se za testiranje učinkovitosti Cyclapent E u smanjenju patološke akumulacije Tau proteina i neurodegeneracije. Ovaj model omogućuje ispitivanje terapijskih učinaka u kontekstu Alzheimerove bolesti.
7T MRI snimanje mozga
Snimanje mozga miševa pomoću visoko-rezolucijskog 7T magnetske rezonancije omogućit će neinvazivno praćenje neurodegenerativnih promjena u moždanoj kori i hipokampusu, procjenu volumena moždanih struktura i usporedbu s kontrolnim skupinama.
Očekivani rezultati
1. Izvješće o učincima Cyclapent E na vitalne stanične parametre (preživljenje, morfologija, povezanost) ljudskih neurona uzgojenih in vitro.
2. Izvješće o učincima Cyclapent E na poticanje O-GlcNAcilacije u 2D i 3D in vitro modelima Alzheimerove bolesti.
3. Izvješće o učinku Cyclapent E na fosforilaciju Tau proteina u modelu ljudskih moždanih organoida za Alzheimerovu bolest.
4. Izvješće o učincima Cyclapent E na smanjenje akumulacije Tau proteina u modelu ljudskih moždanih organoida za Alzheimerovu bolest.
5. Diseminacija rezultata projekta na međunarodnim konferencijama i u obliku najmanje jedne publikacije u časopisu posvećenom biokemijskom i/ili biomedicinskom području.
6. Izvješće o učincima Cyclapent E na poboljšanje preživljenja neurona u modelu ljudskih moždanih organoida za Alzheimerovu bolest.
7. Izvješće o učinkovitosti Cyclapent E u suzbijanju gubitka volumena moždane kore i hipokampusa u mišjem modelu Alzheimerove bolesti.
8. Diseminacija rezultata projekta na međunarodnim konferencijama i u obliku najmanje jedne publikacije u časopisu posvećenom biokemijskom i/ili biomedicinskom području.