Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Utjecaj prehrane na učinak intranazalnog inzulina na kogniciju u štakorskoga modela sporadične Alzheimerove bolesti (AD-INdiet)
Voditeljica projekta: dr. sc. Ana Knezović
Ustrojbena jedinica: Katedra za temeljnu i kliničku farmakologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 18. prosinca 2023. do 17. prosinca 2027. (48 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 192.1161,36 €
Poziv i kod projekta: HRZZ Istraživački projekti (IP); IP-2022-10-1895
Opis projekta
Poremećaj inzulinske signalizacije povezan je s mnogim neurodegenerativnim poremećajima, uključujući Alzheimerovu bolest (AD). Uobičajena je pretpostavka da su neuroni neovisni o inzulinu, ali novi dokazi sugeriraju da inzulin ima ulogu u metabolizmu glukoze u mozgu. Sve veći broj dokaza pokazuje da su inzulinska rezistencija i metabolička disfunkcija posrednici AD-a, što dodatno karakterizira AD kao centralnu metaboličku bolest posredovanu inzulinskom rezistencijom u mozgu. Terapijski potencijal intranazalnog (IN) inzulina ispitivan je u kliničkim studijama koje su uključivale pojedince s blagim kognitivnim oštećenjem i AD-om, a rezultati su pokazali poboljšanje sposobnosti pamćenja. Međutim, iz nepoznatog razloga, u nekoliko studija IN inzulin nije polučio povoljni učinak, što bi moglo biti posljedica još nejasnih molekularnih mehanizama središnjih učinaka inzulina i njegove distribucije nakon IN primjene. Cilj projekta je istražiti središnju i perifernu distribuciju akutno primijenjenog intranazalnog inzulina ovisno o vremenu i dozi. Nadalje, imajući na umu da je prehrana jedna od ključnih komponenti u razvoju metaboličkog sindroma (čimbenika rizika za AD); učinci IN inzulina na kogniciju mogli bi ovisiti o prehrani. Streptozotocin (STZ), analog glukoze, široko se koristi u pretkliničkim istraživanjima za induciranje dijabetesa tipa 1 u pokusnih životinja kada se daje intraperitonealno u visokim dozama, te za induciranje inzulinske rezistencije u mozgu i posljedično sporadičnog oblika AD (sAD), kada se daje intracerebroventrikularno (icv) u malim dozama. U skladu s tim, projekt ima za cilj dodatno istražiti utjecaj prehrane na učinak IN inzulina na kogniciju (prehrana s visokim udjelom masti) u STZ-icv štakorskoga modela sAD-a. Rezultati projekta proširit će znanje o čimbenicima koji utječu na terapijski potencijal intranazalnog inzulina (kognicija), posebno u ovisnosti o stadiju sAD-a i prehrani samih životinja, te će pružiti vrijedne informacije o translaciji rezultata sa životinja na čovjeka i prilagodbi doze inzulina ovisno o metaboličkom statusu pacijenta. Budući da poremećaj inzulina u mozgu može biti u pozadini i drugih bolesti, razjašnjenje terapijskog potencijala IN inzulina od velike je važnosti za modernu neurofarmakologiju.
Ciljevi projekta
Glavni cilj ovog projektnog prijedloga je istražiti regionalnu raspodjelu intranazalno primijenjenog inzulina u mozgu te njegov učinak na kogniciju u štakorskom modelu sporadične Alzheimerove bolesti u ovisnosti o metaboličkom statusu životinje i patološkom stadiju.
Specifični ciljevi projekta:
1. Odrediti razliku u raspodjeli IN primijenjenog regularnog inzulina i regularnog inzulina vezanog za fluorescein (FITC-inzulin) u zdravih štakora u ovisnosti o vremenu nakon akutne primjene:
a) Ispitati moguću prisutnost akutno primijenjenog IN FITC-inzulina u sadržaju želuca (kao posljedicu gutanja);
b) Istražiti razlike u raspodjeli IN primijenjenog FITC-inzulina (detekcija egzogenog inzulina) i običnog regularnog inzulina (detekcija egzogenog + endogenog inzulina) u mozgu, ovisno o vremenu nakon primjene
2. Ispitati raspodjelu i učinak jednokratne IN primijene regularnog inzulina u zdravih štakora u ovisnosti o dozi
a) Istražiti regionalnu aktivaciju inzulinskog receptora u mozgu, ovisno o dozi regularnog inzulina
b) Ispitati raspodjelu i učinak IN inzulina na metabolizam i proteine tau i amiloid β u pojedinim regijama mozga, ovisno o dozi regularnog inzulina i vremenu nakon IN primjene
3. Odrediti terapijski potencijal IN primijenjenog regularnog inzulina u štakorskom modelu sAD-a (učinak na kogniciju i patofiziološka obilježja bolesti), ovisno o poremećaju metaboličkog statusa izazvanog prehranom bogatom mastima
a) Utvrditi učinak kronične primjene IN inzulina pri poremećenom metaboličkom statusu u ranom stadiju sAD b) Utvrditi učinak kronične primjene IN inzulina pri poremećenom metaboličkom statusu u umjereno unzapredovalom stadiju sAD
Metodologija istraživanja
Aktivnosti projekta organizirane su u svrhu provedbe 4-godišnjeg istraživanja kroz 4 in vivo pokusa korištenjem zdravih štakora za određivanje distribucije i učinka akutnog intranazalno (IN) primijenjenog inzulina u ovisnosti o dozi, vremenu i regiji mozga i njegovog mogućeg blagotvornog kroničnog učinka na kognitivne performanse i patofiziologiju u modelu štakora (STZ-icv) koji oponaša sporadičnu Alzheimerovu bolest (sAD) ovisno o životinjskoj prehrani (hrana bogata mastima vs normalna hrana). 1. pokus je usmjeren na istraživanje problematike mogućeg odlaska u ždrijelo i gutanja IN primijenjenog inzulina. Inzulin se relativno brzo razgrađuje u pH vrijednostima ispod 5, pa će se za određivanje progutane količine koristiti regularni inzulin vezan za fluorescein izotiocijanat (FITC) kako bi se prevladala ova prepreka. Inovativni aspekt ovog dijela projekta je dobivanje relativnog omjera progutanog u odnosu na centralno raspoloživi FITC-inzulin (očekivani rezultat), o čemu do sada nema literaturnih podataka. Drugi dio prvog pokusa istražuje razlike u distribuciji FITC-inzulina u odnosu na regularni inzulin u mozgu (nema podataka o usporedbi njihove distribucije) te istražuje regionalne specifičnosti u distribuciji inzulina nakon IN primjene, kako bi se odredilo u kojoj regiji mozga dolazi do najvećeg povećanja koncentracije inzulina (očekivani rezultat), ovisno o vremenu nakon tretmana. Originalni pristup u ovom dijelu istraživanja omogućit će neizravnu procjenu distribucije endogenog inzulina. 2. pokus je usmjeren na određivanje aktivacije signalnog puta inzulinskog receptora (IR) i probira potencijalnih metaboličkih i neuropatoloških markera u ovisnosti o dozi. Kako bi se pronašla prava doza pri kojoj aktivnost IR ne smanjuje inzulinsku signalizaciju, učinak akutnog IN inzulina na IR aktivaciju će se odrediti ovisno o dozi, regiji i vremenu nakon primjene. Osim toga, „screening“ potencijalnih ciljnih proteina, nakon IN inzulina, uključenih u metabolizam i neurodegeneraciju istražit će se korištenjem tehnologije čipova s antitijelima. Očekivani rezultati će nam dati uvid u mehanizam i mogući divergentni učinak inzulina u ovisnosti o regiji mozga. Pokusi 3a i 3b usmjereni su na određivanje terapijskog potencijala regularnog inzulina primijenjenog IN u štakorskom modelu sAD-a i čimbenika koji bi mogli utjecati na njega, kao što je metabolički status štakora uzrokovan prehranom s visokim udjelom masti i stadij sAD-a (rani/3a u odnosu na kasni/3b). Pokus 3 dodatno će omogućiti procjenu može li kronično liječenje IN inzulinom utjecati na GLP-1 sustav u mozgu koji, zajedno s novim otkrićima o utjecaju metaboličke disfunkcije izazvane prehranom s visokim udjelom masti (oponaša onu u stvarnoj životnoj situaciji) i ranog, u odnosu na umjereni, stadija patologije sAD-a, pridonijet će pažljivijem planiranju kliničkih ispitivanja i boljoj prediktivnoj vrijednosti u translaciji terapije IN inzulina u sAD-u sa životinje na čovjeka.
Očekivani rezultati
Rezultati će nam po prvi put dati uvid u relativnu količinu progutanog inzulina u odnosu na centralno raspoloživi nakon primjene IN, što će pridonijeti boljoj translaciji i razumijevanju količine inzulina potrebnog za liječenje IN u ljudi. Osim toga, po prvi će se put zabilježiti raspodjela centralno dostupnog FITC-inzulina u usporedbi s regularnim inzulinom nakon IN primjene na vremenski ovisan način. Točna raspodjela inzulina će razjasniti ne samo distribuciju ovog spoja nakon IN primjene nego i upotrebu drugih spojeva označenih FITC-om čija se distribucija može lako pratiti nakon njegove primjene. Istražiti će se i aktivacija inzulinskog signalnog puta u ovisnosti o regiji mozga i dozi intranazalnog inzulina. Također, snimat će se i analizirati utjecaj aktivacije inzulinskog receptora na parametre uključene u neurodegenerativne procese i metabolizam. Prehrana je jedna od presudnih komponenata u razvoju metaboličkog sindroma koji je čimbenik rizika za AD. Ishodi Exp 3 dat će nam uvid u učinkovitost IN inzulina na kogniciju u štakorskom modelu sAD-a ovisno o prehrani, što se može prenijeti na ljude kako bi im se shodno potrebi mijenjala terapija i saznao njezin mogući ishod. Dodatno, na temelju naših prethodnih rezultata o disfunkcionalnom inkretinskom sustavu u mozgu u STZ-icv modelu štakora, te imajući na umu uzajamni stimulacijski učinak inkretina i inzulina na periferiji, inovativni pristup mjerenja moždanog GLP-1 nakon terapija kroničnim IN inzulinom u Exp 3a i b pružit će nova saznanja o središnjoj interakciji inzulina i GLP-1 koja mogu pridonijeti razjašnjenju molekularnog mehanizma terapijske aktivnosti IN inzulina i pronalaženju novih mogućih ciljeva u procesu razvoja lijekova protiv AD. Kako bi se stekla bolja prediktivna vrijednost u prenošenju rezultata na ljude, strategiju liječenja također treba ispitati u kasnijoj fazi bolesti. Stoga će nam ishodi Exp 3b dati uvid u učinak IN inzulina na kogniciju u umjereno uznapredovalom stadiju štakorskog modela sAD-a i njegovu povezanost s dugotrajnim HFD-om kako bismo imali bolju prediktivnu vrijednost u prenošenju rezultata na ljude, obzirom da terapija za AD obično počinje kasnije u progresiji bolesti.
Projektni tim
prof. dr. sc. Melita Šalković-Petrišić
dr. sc. Ana Knezović
izv. prof. dr. sc. Jelena Osmanović Barilar
dr. sc. Ana Babić Perhoč
dr. sc. Jan Homolak
Davor Virag, dr. med.
izv. prof. dr. sc. Eugenio Barone
Antonia Krsnik, mag. ing. biotechn.
Diseminacija i vidljivost
- Antonia Krsnik, Jelena Osmanovic Barilar, Leonarda Vlahov, Ana Babic Perhoc, Jan Homolak, Davor Virag, Melita Salkovic-Petrisic, Ana Knezovic (2025) Brain-region dependent stress induced insulin concentration increment after intranasal administration. Sudjelovanje na kongresu „Pokusne životinje u znanstvenim istraživanjima 2025“, Zagreb, 05.-06.02.2025.