Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Međuodnos neuronalnog gangliozidoma i mitohondrijskog energetskog metabolizma (NEUROGEM)
Voditeljica projekta: izv. prof. dr. sc. Kristina Mlinac Jerković
Ustrojbena jedinica: Zavod za kemiju i biokemiju i Hrvatski institut za istraživanje mozga, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 15. prosinca 2024. do 14. prosinca 2027. (46 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 199.855,00 €
Poziv i kod projekta: HRZZ Istraživački projekti (IP); IP-2024-05-2453
Opis projekta
Biosinteza gangliozida, dominantnih odrednica glikoma mozga sisavaca, je složen proces u koji su uključene specifične glikoziltransferaze. Upravo su mutacije u genima za pojedine glikoziltransferaze uzrok bolesti svrstanih u skupinu urođenih poremećaja glikozilacije (UPG). Do danas, opisane su mutacije u samo tri gena biosintetskog puta gangliozida u ljudi koje dovode do poremećaja. Za mutacije u genu ST3GALT5 je utvrđeno da su uzrok autosomalnog recesivnog epileptičkog sindroma s početkom u dječjoj dobi, mutacije u genu B4GALNT1 dovode do kompleksnog oblika nasljedne spastične paraplegije, a mutacije u genu ST3GAL3 dovode do sindroma West, odnosno epileptičke encefalopatije. Međutim, još nije razjašnjena patološka kaskada koja povezuje genski uvjetovane poremećaje sinteze gangliozida s njihovim molekularnim i kliničkim fenotipom obilježenim mitohondrijskom disfunkcijom, epileptičkim napadajima, zastojem u razvoju i kognitivnim zaostajanjem. Opisani molekularni fenotip UPG jasno ukazuje na povezanost gangliozida s mitohondrijskim metabolizmom, stoga je jedan od ciljeva projekta provesti detaljnu strukturnu karakterizaciju gangliozida mitohondrijskih membrana i reinterpretirati uvriježeno stajalište o gangliozidima kao količinski i funkcionalno zanemarivim sastojcima mitohondrijskih membrana. Projektom ćemo razjasniti kako promjena sastava gangliozida stanične i mitohondrijske membrane dovodi do mitohondrijske disfunkcije i poremećaja u energetskom metabolizmu neurona. U tu svrhu koristit ćemo ciljanu inaktivaciju gena uključenih u biosintezu gangliozida pomoću CRIPSR-Cas9 tehnologije in vitro čime ćemo generirati biblioteke izogeničnih stanica s različitim sastavom gangliozida. U tako modificiranim ljudskim i mišjim neuronalnim staničnim linijama pratit ćemo izražaj i aktivnost odabranih ionskih transportera, enzima i proteina energetskog metabolizma stanice, koncentraciju odabranih metabolita i iona te fiziološku funkcionalnost mitohondrija. Uspostavljanje ovih staničnih linija predstavlja vrijedan resurs dostupan za istraživanja uloga gangliozida izvan okvira predloženog projekta. Projekt će doprinijeti razumijevanju molekularnog mehanizma uključenog u razvoj urođenih poremećaja glikozilacije, a jedan od očekivanih rezultata je identifikacija potencijalnih novih terapijskih ciljeva u neurološkim poremećajima praćenima narušenom homeostazom energetskog metabolizma
Ciljevi projekta
Opći cilj: Razjasniti kako promjena sastava gangliozida stanične i mitohondrijske membrane dovodi do mitohondrijske disfunkcije i poremećaja u energetskom metabolizmu neurona.
Specifični ciljevi:
1. Utvrđivanje sastava gangliozida mitohondrijske membrane mišjeg moždanog tkiva spektrometrijom masa.
2. Uspostava staničnih linija s inaktiviranim (knock-out, KO) odabranim genima biosinteze gangliozida pomoću CRISPR-Cas9 tehnologije kao trajnog resursa za istraživanje učinaka gangliozida u stanici.
3. Utvrđivanje ekspresije i aktivnosti odabranih ionskih prijenosnika stanične membrane u stanicama s promijenjenim sastavom gangliozida.
4. Određivanje aktivnosti/ekspresije odabranih mitohondrijskih i citosolnih enzima i proteina uključenih u energetski metabolizam u stanicama s promijenjenim sastavom gangliozida. 5. Utvrditi kako promijenjen sastav gangliozida utječe na stanični metabolizam (laktat, ATP, piruvat u citosolu i mitohondrijima) te na transport Ca²⁺, K⁺ i Cl⁻ iona.
Metodologija projektnog istraživanja
Metodologija predviđena ovim projektom uključuje klasične metode izolacije i karakterizacije gangliozida uz komplementarno korištenje modernih biokemijskih metoda i metoda molekularne biologije. Navedene metode uključuju modificiranje staničnih linija CRISPR-Cas9 tehnologijom, karakterizaciju gangliozidoma membrana primjenom spektrometrije masa i imunokemijske vizualizacije, određivanje ekspresije i aktivnosti odabranih proteina i enzima (metode Western blotting, in-cell Western blotting), određivanje koncentracije specifičnih metabolita fluorescentnim indikatorima, određivanje unosa iona pomoću fluorescentnih boja/indikatora.
Mitohondriji će biti izolirani iz mišjeg moždanog tkiva optimiziranom metodom, koristeći magnetski obilježena protutijela, bez kontaminacije ostalim staničnim membranama. Gangliozidi iz mitohondrijskih frakcija bit će pročišćeni i analizirani kromatografijom visoke sposobnosti razlučivanja (HPTLC) uz vizualizaciju rezorcinol–HCl reagensom, immunoblotom te spektrometrijom masa. Dodatno, provest će se vizualizacija (imaging) gangliozida u izolianim mitohondrijima koristeći specifična protutijela na gangliozide te konfokalnu mikroskopiju na našoj i suradnim ustanovama.
U najopsežnije dijelu istraživanja koristit ćemo koristit ćemo kombinatoran pristup kojim ćemo inaktivirati specifične glikoziltransferaze uključene u biosintezu gangliozida kako bismo razvili biblioteke izogeničnih stanica s različitim sastavom gangliozida. Ovaj pristup mijenjanja staničnih glikozilacijskih obrazaca poput slaganja lego kockica (engl. „lego toying“) se sve više u primjeni u glikobiologiji s ciljem proučavanja glikofenotipa, najviše glikoproteoma, a tek rijetko za sintezu glikosfingolipida. Prema dostupnim informacijama, ovakav pristup se ne koristi za istraživanje učinaka gangliozida na različite stanične procese, a napose ne na mitohondrije. Stoga, generiranje predloženih staničnih linija predstavlja izrazito vrijedan resurs koji će omogućiti dugoročno istraživanje gangliozida te će potencijalno dovesti do boljeg razumijevanja njihovih fizioloških uloga.
U eksperimentima će se koristiti mišja stanična linija Neuro-2a i ljudska stanična linija SH-SY5Y te njihove CRISPR-Cas9 knock-out varijante s inaktiviranim odabranim genima biosinteze gangliozida. U modificiranim staničnim linijama određit će se ekspresija i aktivnost odabranih enzima uključenih u transport iona te odabranih enzima uključenih u mitohondrijski energetski metabolizam. Aktivnost enzima respiratornog lanca, Krebsova ciklusa i drugih odabranih mitohondrijskih i citosolnih enzima mjerit će se spektrofotometrijski pomoću komercijalnih setova. Koncentracije metabolita (piruvat, ATP) i iona (Ca²⁺, K⁺, Cl⁻) određivat će se fluorescentnim kemijskim indikatorima.
Očekivani rezultati
1. Određivanjem sastava i strukturnom karakterizacijom mitohondrijskih gangliozida ponudit ćemo reinterpretaciju stajališta o gangliozidima kao funkcionalno zanemarivim komponentama mitohondrijskih membrana.
2. Generiranje staničnih linija s promijenjenim sastavom gangliozida kao izrazito vrijednog resursa će omogućiti dugoročno istraživanje gangliozida te će potencijalno dovesti do boljeg razumijevanja njihovih fizioloških uloga. Stanice će biti pohranjene i korištene izvan trajanja i opsega ovog projekta, te od dostupne drugim skupinama koje se bave istraživanjem gangliozida.
3. Ispitivanje ekspresije i aktivnosti ciljnih enzima koji izravno sudjeluju u staničnoj bioenergetici u staničnim linijama s različitim sastavom gangliozida doprinijet će razjašnjavanju biokemijskog fenotipa koji je primijećen u pacijentima s urođenim poremećajima glikozilacije gangliozida, u prvom redu s mutacijama u genu ST3GAL5 koje su uzrok epileptičkog sindroma s početkom u dječjoj dobi.
4. Praćenje koncentracije specifičnih metabolita i iona te analiza izabranih aspekata mitohondrijske funkcije (poput otvaranja mitohondrijske permeabilizacijske pore) doprinijet će sveobuhvatnom razumijevanju patoloških posljedica poremećenog sastava gangliozida u neuronalnim stanicama.
Projektni tim
MEFZG
1. izv. prof. dr. sc. Kristina Mlinac Jerković
2. izv. prof. dr. sc. Vladimir Damjanović
3. Eva Josić, mag.chem.
4. prof. dr. sc. Svjetlana Kalanj-Bognar
5. Adriana Lipovčić, mag.chem.
6. dr.sc. Borna Puljko
7. dr.sc. Ana Ujević
Partneri
1. dr. sc. Nikolina Maček Hrvat, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada, Zagreb
2. dr. sc. Katarina Ilić, Department of Neuroimaging, BRAIN Centre, King’s College London, UK
3. prof. dr. sc. Ronald L. Schnaar, Department of Pharmacology and Molecular Sciences i Department of Neuroscience, School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, SAD
4. prof. dr. sc. Alina D. Zamfir, National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
5. dr. sc. Raluca Ica, National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
6. dr. sc. Mirela Sarbu, National Institute for R&D in Electrochemistry and Condensed Matter (INCEMC) i West University of Timisoara, Temišvar, Rumunjska
7. doc. dr. sc. Rodrigo Herrera-Molina, George Washington University, Washington, SAD; Bernardo O‘Higgins University, Santiago, Čile