Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Komparativna proteomska analiza specifičnih klasa neurona subtalamičke jezgre (PROTSTAN)
Voditelj projekta: izv. prof. dr. sc. Goran Sedmak
Ustrojbena jedinica: Hrvatski institut za istraživanje mozga, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 20. prosinca 2024. do 19. prosinca 2027. (36 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 199.900,00 €
Poziv i kod projekta: HRZZ Istraživački projekti (IP); IP-2024-05-8297
Opis projekta
Subtalamička jezgra (STN) mala je, konveksna jezgra smještena u diencefalonu. STN je ključna struktura bazalnih ganglija s važnom ulogom u regulaciji motoričkih funkcija. STN je kompleksna jezgra koja prima projekcije iz mnogih moždanih područja (moždane kore, diencefalona, mezencefalona), te je sastavljena od projekcijskih (glutamatergičkih) i lokalnih (GABAergičkih) neurona. Zanimljivo je što postoje značajne razlike u prostornoj raspodjeli i sastavu aksona koji STN prima te i u vrstama neurona prisutnim u STN. Npr. interneuroni su dokazani jedino u ljudskom mozgu, dok kod drugih životinjskih vrsta nedostaju. Posljednjih godina STN je postala važna terapijska struktura za postupak duboke mozgovne stimulacije (npr. Parkinsonova bolest, bolesti ovisnosti, Touretteov sindrom, itd.), te ključna struktura za razumijevanje patogeneze mnogih bolesti (npr. Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest, distonije, itd.).Zbog svoje ključne uloge u motoričkoj kontroli, razumijevanje molekularne i stanične građe STN je ključno za otkrivanje patogeneze poremećaja pokreta te razvoja efikasnih terapijskih postupaka. Komparativna proteomska analiza pruža nam moćan alat za istraživanje specifičnih neuronskih podskupina u STN, te razotkrivanje molekularnog profila i funkcijskih karakteristika koje razlikuju ove podskupine unutar iste vrste te između vrsta. U ovom znanstvenom projektu cilj nam je provesti sveobuhvatnu komparativnu proteomsku analizu podskupina STN neurona, te otkriti molekularne razlike i sličnosti koje su podloga različitih funkcija ovih neuronskih podskupina. Istraživanjem proteomskog krajolika STN, produbit ćemo naše razumijevanje njezine uloge u motoričkoj kontroli. Također, dobiveni podaci mogu nam pomoći poboljšati dostupne terapije za poremećaje pokreta.
Ciljevi projekta
Opći cilj: Opći cilj projekta sveobuhvatna je komparativna proteomska analiza podskupina STN neurona kod miša, štakora i čovjeka te njihovih molekularnih obilježja koja bi mogla predstavljati temelj različitih funkcija ovih podskupina neurona.
Specifični ciljevi:
1. Istražiti specifične klase neurona subtalamičke jezgre kod miša, štakora i čovjeka
2. Istražiti proteom klasa neurona subtalamičke jezgre miša
3. Istražiti proteom klasa neurona subtalamičke jezgre štakora
4. Istražiti proteom klasa neurona subtalamičke jezgre čovjeka
5. Istražiti razlike između klasa neurona subtalamičke jezgre unutar i između vrsta
Metodologija projektnog istraživanja
Istraživanje će biti provedeno na muškim i ženskim uzorcima subtalamičke jezgre miša, štakora i čovjeka. Barem pet uzoraka će biti korišteno po vrsti i po spolu. Uzorci mozga (subtalamičke jezgre) sve tri vrste bit će fiksirani u 4% puferiranom paraformaldehidu ili svježe smrznuti. Fiksirani uzorci bit će krioprotektirani ili uklopljeni u parafin. Blokovi koji sadrže STN bit će rezani na 10 ili 20 um te će se na tim rezovima provesti imunohistokemijski i imunofluorescentni eksperimenti kao i in situ RNA analiza. Na izolatima proteina iz svježe smrznutih uzoraka mozga miša, štakora i čovjeka učinit će se Western blot analiza kako bi se validirala protutijela za imunohistokemijske eksperimente te će samo tako validirana protutijela biti korištena za imunohistokemijske eksperimente. Imunohistokemijskim i imunofluorescentnim metodama označene podskupine STN neurona bit će izolirane metodom laserske mikrodisekcije kako bi se na njima učinila proteomska analiza. Uzorci neurona iz iste vrste i spola bit će udruženi u isti uzorak za izolaciju proteina. Izolirani proteini će biti analizirani tekućinskom kromatografijom (Thermo Scientific UltiMate 3000, CroRIS ID: 3467 i 3468) udruženom s masenom spektrometrijom (Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery, CroRIS ID: 3466) kako bismo dobili proteom specifičnih populacija neurona. Koristit ćemo računalne, bioinformatičke i statističke metode za analizu i usporedbu dobivenih proteoma različitih populacija neurona kako bismo mogli istražiti razlike između i unutar vrsta, kao i razlike između spolova. Vizualizacija rezultata imunohistokemijskih i in situ RNA eksperimenata učinit će se konfokalnim mikroskopom Olympus Fluoview FV3000RS, CroRIS ID: 2167.
Očekivani rezultati
Rezultati ovog projekta omogućit će nam definiranje podskupina subtalamičkih neurona kod mišta, štakora i čovjeka. Na temelju tih rezultata moći ćemo usporediti razlike u molekularnom profilu subtalamičkih neurona unutar i između vrsta te predložiti bolji animalni model za istraživanje poremećaja pokreta kod čovjeka.
Projektni tim
1. izv. prof. dr.sc. Goran Sedmak (MBZ: 301886), voditelj, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
2. prof.dr.sc. Miloš Judaš, (MBZ: 136185) suradnik, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
3. prof.dr.sc. Lovorka Grgurević (MBZ: 227434), suradnica, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
4. dr.sc. Ruđer Novak (MBZ: 287444), suradnik, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
5. doc.dr.sc. Andrija Štajduhar (MBZ: 375813), suradnik, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
6. dr.sc. Ema Bokulić (MBZ: 373706), suradnica, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
7. Tila Medenica, mag.biol.mol. (CroRIS ID 44879), suradnica, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
8. Slavica Martinović, dr.med. (CroRIS ID 46988), suradnica, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
9. Anton Mažuranić, dr.med. (CroRIS ID 41095) suradnik, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
Diseminacija i vidljivost projekta
Publikacije
Medenica, Tila; Bokulić, Ema; Sedmak, Goran. The subthalamic nucleus: from comparative neuroscience to the presumptive role in canine cognition, behavior, and behavioral disorders // Journal of Veterinary Behavior-Clinical Applications and Research, 82 (2025), 75-88. doi: 10.1016/j.jveb.2025.11.001
Kongresi
Bokulić, Ema; Medenica, Tila; Sedmak, Goran. Developmental dynamics of the expression of calcium-binding proteins in the human fetal subthalamic nucleus // FENS Regional Meeting 2025 Abstract book. Oslo, 2025