Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Otkrivanje neurorazvojne osnove Downovog sindroma pomoću jedinstvenih organoida ljudskog mozga (DevDown)
Voditelj projekta: prof. dr. sc. Dinko Mitrečić
Ustrojbena jedinica: Katedra za histologiju i embriologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Trajanje projekta: od 25. prosinca 2023. do 24. prosinca 2027. (48 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 199.084,21 €
Poziv i kod projekta: Istraživački projekti (IP); IP-2022-10-4656
Sažetak projekta
Downov sindrom je najčešći kromosomski poremećaj u čovjeka i najčešći uzrok teških dijagnoza poput demencije i srčanih malformacija. Unatoč činjenici da su kod osoba s Downovim sindromom neke regije mozga manje, s plićim brazdama, u usporedbi s mozgom disomičnih osoba, još uvijek ne razumijemo razvojnu osnovu ovih malformacija. Praznine u našem znanju su primarno uzrokovane nemogućnošću modeliranja ljudske kortikogeneze na životinjskim modelima. Također, tkivo ljudskih zametaka je rijetko dostupno i donosi značajne varijabilnosti između uzoraka. Stoga je potreban posve nov metodološki pristup kako bismo razumjeli poremećen razvoj mozga kod Downovog sindroma. Naša grupa je uspostavila jedinstvene stanične linije od osobe koja je mozaik za Downov sindrom, tj. sve uočene razlike između trisomičnih i disomičnih stanica mogu se pripisati isključivo dodatnom setu kromosoma 21. Nadalje, uspostavili smo protokol uzgoja organoida mozga koji tijekom 100 dana diferencijacije razvijaju sve slojeve ljudske moždane kore. Budući da naši preliminarni podaci ukazuju na to da se trisomične stanice diferenciraju na drugačiji način, naša hipoteza je da je razvoj kore mozga kod Downovog sindroma poremećen, što također uključuje poremećena formiranje sinapsi. U ovom projektu ćemo analizirati kako se trisomični neuroni diferenciraju i kako stvaraju sinapse tijekom razvoja slojeva moždane kore tijekom diferencijacije organoida. Budući da pretpostavljamo kako je gen S0D1 na 21. kromosomu jedan od glavnih uzroka ovih poremećaja, upotrijebit ćemo CRISPR tehnologiju kojom ćemo ukloniti treću kopiju S0D1 te promatrati mogu li se tako ispraviti neki od uočenih poremećaja. Ovaj projekt će unaprijediti razumijevanje razvojne osnove Downovog sindroma, ali i drugih stanja u kojima se mozak ne razvija normalno. Ako smanjeni broj kopija S0D1 poboljša kortikogenezu, to bi otvorilo mogućnost farmakološkog liječenja fetusa s ciljem smanjenja težine fenotipa ovog kromosomskog poremećaja.
Ciljevi projekta
Projekt DevDown ima jednostavnu strukturu u pogledu ciljeva, vremenskih okvira i resursa. U 4 godine planiramo odgovoriti na 4 velika pitanja. Prvi je cilj morfološki usporediti disomične i trisomične stanice (dio za stanične kulture, dio za histološke analize i dio za molekularne analize). Druga godina će se fokusirati na kortikogenezu, pa ćemo iz analiza na razini pojedinačnih stanica preći na analize specifičnih elemenata formiranja slojeva korteksa mozga. Treća godina će biti posvećena stvaranju i oblikovanju sinapsi. Osim proračuna za stanične kulture, morfološke analize i analize RNA i proteina, dodali smo proračun za vizualizaciju sina psi pomoću virusnih konstrukata. Četvrta godina će biti posvećena uklanjanju treće kopije SOD1 iz trisomičnih stanica, pa je stoga dodano u proračun dio za CRISPR.
Metodologija istraživanja
Glavna istraživačka pitanja koje projekt DevDown želi odgovoriti jesu: zašto osobe s Downovim sindromom posjeduju manji mozak s nesrazmjerno razvijenim različitim dijelovima korteksa? Možemo li tijekom diferencijacije stanica i razvoja mozga otkriti trenutak iz kojeg taj fenotip potječe? Možemo li razumjeti mehanizam tijekom razvoja korteksa koji je odgovoran za malformacije? Možemo li otkriti gen koji je odgovoran za barem dio ovih poremećaja, što bi u teoriji otvorilo mogućnost inhibicije dodatnih kopija u trisomičnim fetusima farmakološkim tretmanom? Ovaj se projekt temelji na jedinstvenoj metodologiji: posjedujemo jedinstvenu staničnu liniju osobe koja je mozaik s Downovim sindromom, tj. sve uočene razlike između trisomičnih i disomičnih stanica mogu se pripisati isključivo dodatnom setu kromosoma 21. To je velika prednost jer sve objavljene analize koje uspoređuju disomične i trisomične mozgove nose teret među-individualnih razlika, što se jasno vidi kod često heterogenih i kontradiktornih zapažanja. Štoviše, razvili smo napredni organoidni sustav koji tijekom 100 dana diferencijacije razvija sve slojeve ljudskog korteksa. Drugim riječima, sada posjedujemo zaista moćan alat, in vitro model ljudskog mozga u kojem ćemo usporediti razlike u sekvenci kortikogeneze između trisomičnih i disomičnih stanica koje potječu od iste osobe. Budući da smo nedavno nabavili light-sheet mikroskop posebno dizajniran za snimanje malih dijelova (fetalnog) mozga ili cijelog organoida, moći ćemo dobiti slike koje će vizualizirati sve glavne korake u razvoju korteksa. U kombinaciji s našom jedinstvenom ekspertizom u kortikogenezi i razvoju ljudskog mozga, prikupit ćemo podatke koji se ne bi mogli dobiti bez ovog metodološkog pristupa. Sljedeći metodološki stup ovog projekta je jedinstvena kombinacija asembleoida i virusnog oslikavanja sinaptogeneze koja će nam donijeti vrijedne podatke o pretpostavljenim razlikama u formiranju sinapsi između trisomičnog i disomičnog modela mozga. Nadalje, koristit ćemo već pripremljene probe za CRISPR, čime ćemo reducirati trostruki broj SOD1 na normalan broj. Na taj način ćemo dobiti vrlo vrijedne podatke u kojoj mjeri korekcija broja kopija 5OD1 ispravlja opažene poremećaje.
Očekivani rezultati
Najznačajniji očekivani rezultati projekta DevDown će biti:
1) Usporedba morfoloških značajki trisomičnih i disomičnih stanica;
2) Usporedba procesa in vitro modela kortikogeneze u trisomičnim i disomičnim organoidima;
3) Usporedba dobivenih razlika s našom jedinstvenom zbirkom mozgova ljudskih zametaka;
4) Usporedba slijeda sinaptogeneze između trisomičnih i disomičnih organoida mozga;
5) Analiza hoće li normalizacija broja kopija SOD1 u trisomičnom tkiva ispraviti neke od opaženih poremećaja.
Projektni tim
prof. dr. sc. Dinko Mitrečić
doc. dr. sc. Ivan Alić
dr. sc. Nina Krešić
Ante Plećaš, dr. med. vet.
Ana Bekavac, mag. biol. exp.
Olesia Kalmukova
dr. sc. Aoife Murray
prof. dr. sc. Dean Nižetić
dr. sc. Jasmina Isaković
Nina Kosi Bijelić, dr. med.
Paula Stančin, mag. biol. exp.