Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Lateralna arhitektura za istraživanje i procjenu erozije tkiva u laboratorijskim modelima reumatoidnog artritisa
Naziv projekta na engleskom jeziku: Lateral Architecture for Tissue-Erosion Research and Assessment in Laboratory Rheumatoid Arthritis Models
Akronim projekta: LATERAL-RA
Voditelj projekta: doc. dr. sc. Alan Šućur, dr. med.
Ustrojbena jedinica: Katedra za fiziologiju i imunologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Partneri na projektu: IZIT d.o.o., Sveta Nedelja (izrada PLA/HA nosača i kućišta čipa), University of Cincinnati, SAD (znanstveno savjetovanje (organ-na-čipu, mikrofluidika)), Klinički bolnički centar Zagreb (klinička suradnja (uzorci bolesnika))
Trajanje projekta: od 2. studenog 2026. do 31. listopada 2029. (36 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 200.000,00 €
Izvor financiranja: Hrvatska zaklada za znanost (HRZZ), Istraživački projekti (IP); šifra projekta: IP-2026-2982
Opis projekta
Reumatoidni artritis (RA) kronična je autoimunosna bolest zglobova. U Hrvatskoj od RA boluje oko 20.000 osoba, a u Europi više od 5 milijuna. Nepovratna erozija kosti glavni je uzrok trajne onesposobljenosti. Erozija nastaje na granici između upaljene sinovije (panusa) i kosti. Na toj granici kost razgrađuju osteoklasti. Osteoklasti nastaju iz monocita, krvnih stanica koje ulaze u upaljeni zglob.
Postojeći pretklinički modeli ne prikazuju kako se taj proces odvija u prostoru i vremenu. Životinjski modeli slabo predviđaju odgovor bolesnika na terapiju. Modeli organ-na-čipu (engl. organ-on-a-chip) mikrofluidni su sustavi u kojima ljudske stanice rastu u uvjetima sličnima onima u tkivu. Postojeći modeli organ-na-čipu za eroziju kosti imaju odjeljke postavljene jedan iznad drugoga (vertikalna arhitektura). U toj arhitekturi mineralizirani sloj blokira optički put, pa mikroskop ne može snimati mjesto razaranja kosti u stvarnom vremenu.
Projekt LATERAL-RA razvija horizontalni čip s tri odjeljka: krvožilnim odjeljkom, odjeljkom panusa i koštanim odjeljkom. Odjeljci se nalaze jedan pokraj drugoga, u istoj ravnini. Zato mikroskop može neprekidno snimati mjesto erozije. Čip sadrži: (1) 3D bioprintani model panusa s gradijentom krutosti i sinovijalnim fibroblastima bolesnika s RA; (2) acelularni nosač od polilaktida i hidroksiapatita (PLA/HA), koji je jedina meta erozije; (3) mikrofluidni kanal obložen endotelnim stanicama.
Projekt traje 36 mjeseci i ima tri faze. U prvoj godini tim izrađuje i ispituje module čipa. U drugoj godini tim unosi u čip podskupine monocita iz krvi bolesnika s RA. Tim prati kako monociti izlaze iz krvožilnog kanala, putuju kroz panus i na površini kosti postaju osteoklasti. U trećoj godini tim izlaže čipove s monocitima pojedinog bolesnika lijekovima koji mijenjaju tijek bolesti (DMARD, engl. disease-modifying antirheumatic drugs). Tim mjeri koliko lijek smanjuje eroziju i uspoređuje rezultat s kliničkom aktivnošću bolesti istog bolesnika. Dugoročno, tim želi razviti test koji na stanicama pojedinog bolesnika predviđa učinak lijeka prije početka liječenja. Takav test može smanjiti broj neučinkovitih terapija: 30–40 % bolesnika ne postiže trajnu remisiju uz biološke DMARD lijekove. Projekt ne upotrebljava pokusne životinje i slijedi načela 3R (zamjena, smanjenje i poboljšanje upotrebe životinja u istraživanjima).
Ciljevi projekta
Opći cilj
Razviti, validirati i primijeniti novi horizontalni čip s tri odjeljka temeljen na ljudskim stanicama. Čip ima dvije namjene: (1) istražiti prostornu i vremensku dinamiku diferencijacije monocita u osteoklaste na erozijskoj fronti u RA; (2) predvidjeti učinak lijekova na zaustavljanje erozije kod pojedinog bolesnika.
Specifični ciljevi
1. Radni paket 1 (RP1), 1.–12. mjesec: Izraditi i ispitati tri horizontalna modula: acelularni PLA/HA koštani nosač, 3D bioprintani model panusa od decelulariziranog izvanstaničnog matriksa (dECM) i mikrofluidni kanal obložen endotelom. Potvrditi da sastavljeni čip ne propušta tekućinu pod perfuzijom.
2. RP2, 13.–24. mjesec: Mapirati prostorno-vremenski gradijent diferencijacije dviju podskupina monocita bolesnika s RA: klasičnih (CD14++CD16−) i intermedijarnih (CD14++CD16+). Praćenje obuhvaća put od ekstravazacije (izlaska iz krvožilnog kanala), preko lateralne migracije, do diferencijacije u osteoklaste. Metode: precizna zonska mikrodisekcija, qPCR i protočna citometrija.
3. RP3, 21.–36. mjesec: Validirati čip kao prediktivni alat za procjenu učinka lijekova na zaustavljanje erozije kod pojedinog bolesnika. Izmjeriti oslobađanje kalcija iz nosača nakon izlaganja standardnim DMARD lijekovima (metotreksat, anti-TNF) i usporediti rezultate s kliničkim indeksom aktivnosti bolesti DAS28-CRP.
Metodologija projektnog istraživanja
Izrada čipa. IZIT d.o.o. izrađuje kućište čipa na 3D pisaču Stratasys J5 DentaJet od biokompatibilne, optički prozirne smole MED620. IZIT d.o.o. izrađuje i resorptivni PLA/HA koštani nosač. Teksturometar TA.XTplus C mjeri krutost nosača i panusa.
3D bioprint panusa. Tim izdvaja sinovijalne fibroblaste iz tkiva bolesnika s RA, dobivenog tijekom operacija zglobova. Bioprinter Cellink BioX6 ispisuje stanice u biotinti od decelulariziranog izvanstaničnog matriksa (dECM).
Endotelna barijera i protok. Endotelne stanice ljudske pupčane vene (HUVEC) oblažu mikrofluidni kanal. Imunofluorescencija i test propusnosti potvrđuju cjelovitost barijere. Sustav Elveflow OB1 Mk4 regulira protok medija.
Monociti bolesnika. Sortirač stanica BD FACSAria Fusion izdvaja podskupine monocita iz krvi bolesnika s RA (najmanje 10 bolesnika u RP2 i 6 bolesnika u RP3).
Snimanje. Fluorescencijski sustav EVOS M5000 snima migraciju monocita kroz čip tijekom 72 sata (time-lapse). Konfokalni mikroskop Olympus FV3000 daje završne snimke visoke rezolucije.
Zonska analiza. Nakon uzgoja tim dijeli panus na tri zone preciznom zonskom mikrodisekcijom. Protočni citometar BD Symphony A1 i qPCR (ABI Prism 7500) određuju biljege diferencijacije osteoklasta u svakoj zoni.
Mjerenje erozije. Kolorimetrijski test mjeri kalcij koji se oslobađa iz nosača tijekom resorpcije. ELISA mjeri aktivnost enzima TRAP. Spearmanova korelacija uspoređuje rezultate čipa s kliničkim pokazateljima bolesnika (DAS28-CRP, radiografski nalazi).Etika i kvaliteta. Tim prikuplja uzorke uz informirani pristanak bolesnika i odobrenje etičkih povjerenstava Medicinskog fakulteta i KBC-a Zagreb. Tim analizira mjerenja slijepo, bez poznavanja vrste tretmana, i prethodno registrira protokol RP3 na platformi OSF.
Očekivani rezultati
1. Validirani horizontalni čip s tri odjeljka: standardni operativni postupci (SOP) za tri modula i protokol sastavljanja čipa bez propuštanja (RP1).
2. Prostorno-vremenska mapa diferencijacije monocita u osteoklaste na 3D modelu erozijske fronte (RP2). Mapa uključuje kinetiku migracije (kemotaktički indeks, brzinu i usmjerenost kretanja) i molekularni profil u tri zone panusa.
3. Dokaz koncepta personaliziranog ex vivo testa za procjenu učinka metotreksata i anti-TNF terapije na zaustavljanje erozije, uz korelaciju s indeksom DAS28-CRP (RP3).
4. Znanstveni radovi u otvorenom pristupu: rad o inženjerstvu čipa u Q1 časopisu (do 24. mjeseca), metodološki rad o SOP-ovima (STAR Protocols / protocols.io) i završni rad o rezultatima RP2 i RP3.
5. Otvoreni podatci i resursi: skupovi podataka na Zenodu (CC-BY 4.0) najkasnije 6 mjeseci nakon objave rada, CAD datoteke kućišta čipa na NIH 3D Print Exchange, makronaredbe za FIJI/ImageJ i R skripte na GitHubu (licenca MIT).
Projektni tim
Popis osoba projektnog tima s Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
1. doc. dr. sc. Alan Šućur, dr. med. – voditelj projekta
2. prof. dr. sc. Nataša Kovačić, dr. med.
3. dr. sc. Sara Aničić, dr. med. – poslijedoktorandica
4. doc. dr. sc. Ivan Padjen, dr. med.
5. prof. dr. sc. Mislav Jelić, dr. med.
6. Sara Priselac, dr. med. – doktorandica
7. Tomislav Balen, dr. med. – doktorand
Popis osoba projektnog tima partnera
1. doc. dr. sc. Riccardo Barrile – University of Cincinnati, SAD (znanstveni savjetnik)
2. Amir Šećerkadić – viši inženjer za aditivnu proizvodnju, IZIT d.o.o.
3. Marko Perić – inženjer za aditivnu proizvodnju, IZIT d.o.o.
Diseminacija i vidljivost projekta
– Kongresi: godišnji sastanak European Organ-on-Chip Society (EUROoCS; 1. godina); kongres EULAR ili drugi reumatološki kongres (2. godina); TERMIS-EU ili drugi skup o tkivnom inženjerstvu (3. godina); godišnji sastanak Hrvatskog imunološkog društva (HID; 1.–3. godina).
– Publikacije: dopunit će se tijekom provedbe projekta.
– Mrežna vidljivost: sažeci za javnost na hrvatskom i engleskom jeziku na mrežnim stranicama MEF-a i Laboratorija za molekularnu imunologiju (MOLIM); projektna stranica na ResearchGateu, tromjesečno ažurirana; ORCID profil voditelja; društvene mreže MEF-a.
– Javnost i bolesnici: edukacijski seminar za bolesnike u suradnji s udrugom bolesnika s reumatskim bolestima (3. godina).
– Prijenos tehnologije: analiza patentabilnosti horizontalnog čipa s Uredom za transfer tehnologije Sveučilišta u Zagrebu (2. godina).