Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Mehanizmi lipotoksičnosti u akutnoj mijeloičnoj leukemiji
Naziv projekta na engleskom jeziku: Mechanisms of lipotoxicity in acute myeloid leukemia
Akronim projekta: LipoAML
Voditelj projekta: doc. dr. sc. Vilma Dembitz
Ustrojbena jedinica: Zavod za fiziologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Partneri na projektu: KBC Zagreb, KB Dubrava, Institute for Cancer Research, London, UK, Sveučilište Rennes, Francuska
Trajanje projekta: od 1. travnja 2026. do 31. ožujka 2031. (60 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 299.945,00 €
Izvor financiranja: Hrvatska zaklada za znanost, Uspostavni istraživački projekti ()
Opis projekta
Unatoč novim odobrenim terapijama za liječenje akutne mijeloične leukemije (AML) u posljednjem desetljeću, prognoza bolesti i dalje je loša. To naglašava potrebu za identificiranjem novih molekularnih ciljeva. Promjene staničnog metabolizma značajka su maligne stanice i nude priliku za farmakološke intervencije zbog mogućnosti razvoja ciljanih enzimskih inhibitora. Naše prethodno istraživanje pokazalo je da je stearoil-CoA desaturaza (SCD) neovisni prognostički biljeg i metabolička ranjivost u AML-u. Inhibicija SCD-a (SCDi) dovodi do poremećaja ravnoteže zasićenih masnih kiselina (SFA) i mononezasićenih masnih kiselina (MUFA), no osnovni mehanizmi lipotoksičnosti koji izazivaju smrt leukemijskih stanica još uvijek nisu jasni. Preliminarni podaci sugeriraju da SCDi može utjecati na više putova, uključujući odgovor na nepravilno savijanje proteina (engl. unfolded protein response, UPR), ciklus aktivirane metilne skupine i sintezu sfingolipida, koji svi mogu doprinijeti staničnoj toksičnosti. Potencijalna poveznica između tih putova je promjena u omjeru NAD(P)+/NAD(P)H koja se javlja kao odgovor na SCDi. U ovom projektu cilj nam je istražiti ulogu UPR-a u lipotoksičnosti u odgovoru na SCDi, istražiti promjene u omjeru NAD(P)+/NAD(P)H i njegovu povezanost s indukcijom oštećenja DNA, ispitati aktivaciju ciklusa aktivirane metilne skupine nizvodno od poremećaja NAD(P)+/NAD(P)H i analizirati promjene u profilima sfingolipida u stanicama tretiranim SCDi i palmitatom. Ovi ciljevi pružit će uvid u potencijalne kombinacijske terapije koje uključuju SCDi. Nadalje, kako bismo povećali translacijski utjecaj naših nalaza, planiramo optimizirati uvjete u kulturi stanica i preciznije replicirati stanično i metaboličko okruženje u organizmu, uključujući razvoj 3D modela stanične kulture AML. Podaci iz in vitro istraživanja bit će uspoređeni s kliničkim odgovorom na terapije koje se koriste u praksi, kao i s rezultatima iz mišjih modela za spojeve koji su još uvijek u istraživanju.
Ciljevi projekta
Opći cilj: Istražiti mehanizme stanične smrti u odgovoru na neravnotežu nezasićenih i zasićenih masnih kiselina u leukemijskim stanicama
Specifični ciljevi:
1. Daljnje razjašnjavanje uloge UPR-a u lipotoksičnosti posredovanoj SCDi-om u AML stanicama.
2. Validacija promjena u omjeru NAD(P)+/NAD(P)H kao odgovoru na SCDi i određivanje njihove povezanosti sa staničnom smrti, indukcijom oštećenja DNA i aktivacijom ER stresa.
3. Istražiti ulogu metabolizma aktiviranih metilnih skupina i aktivnosti MTHFD u regeneraciji NADP+ kao odgovor na SCDi.
4. Opisati promjene u profilu i metabolizmu sfingolipida nakon indukcije lipotoksičnosti pomoću SCDi ili nakupljanjem palmitata
5. Definirati fiziološki točnije metaboličke uvjete za kulturu AML-a i uspostaviti 3D modele stanične kulture. Provjeriti osjetljivost na SCDi i odobrene antileukemijske agense u ovim uvjetima in vitro.
Metodologija projektnog istraživanja
Osnovni stanični modeli projekta bit će panel komercijalno dostupnih AML staničnih linija (K562, MOLM-13/MOLM-14, MV-4-11, OCI-AML3, THP-1 i HL-60), prethodno karakteriziranih prema osjetljivosti na inhibiciju stearoil-CoA desaturaze (SCD), uz mišje i ljudske stromalne stanice (MS-5, HS-5 i HS-27a) za modeliranje tumorskog mikrookruženja. Sve linije bit će redovito obnavljane, STR-tipizirane i kontrolirane na mikoplazmu. U pokusima će se koristiti standardni uvjeti uzgoja, a u ko-kulturama stromalne će se stanice prethodno adherirati.
Projekt će se nadograditi na postojeći EHA projekt koji uključuje približno 100 primarnih AML uzoraka iz Zagreba, Toulousea i Barts Cancer Institutea te njihovu genomsku, transkriptomsku, proteomsku, metabolomsku i lipidomsku karakterizaciju. Dobivena baza podataka koristit će se za ispitivanje povezanosti osjetljivosti na SCD inhibiciju s ER stresom, metabolizmom aktiviranih metilnih skupina i sfingolipidnom signalizacijom. Dodatno će se prikupljati novi primarni uzorci, s naglaskom na uparene uzorke dijagnoze i relapsa. Za validaciju rezultata koristit će se primarni AML uzorci nakon uklanjanja T-stanica, u 2D i 3D modelima, uz procjenu vijabilnosti, apoptoze i imunofenotipa protočnom citometrijom.
Lipotoksičnost će se inducirati inhibitorima SCD (SSI-4/MTI-301 i A939572) te palmitatom, a specifičnost će se potvrđivati genetskim utišavanjem SCD. Sinergije s drugim spojevima procjenjivat će se Bliss i Loewe metodama.
U Cilju 1 istražit će se uloga ER stresa i UPR-a primjenom vremenskih qPCR analiza, Western blota, farmakološke inhibicije i genetskih intervencija usmjerenih na PERK, IRE1 i XBP1.
Cilj 2 usmjeren je na ulogu NAD(P)+/NAD(P)H metabolizma. Dinamika NADPH i NADH pratit će se fluorescentnim senzorima i potvrditi biokemijskim testovima i LC-MS analizom, uz manipulaciju NAD+ metabolizmom, PARP-om, SIRT1, NADK-om i NAMPT-om.
U Cilju 3 istražit će se povezanost SCD inhibicije s metabolizmom aktiviranih metilnih skupina i regeneracijom NADP+, uključujući praćenje metabolizma pomoću izotopnog obilježavanja ^13C-serinom i ^13C,^15N-glutaminom te manipulaciju MTHFD1/2, GOT1 i ME1.
Cilj 4 ispitat će ulogu sfingolipidnog metabolizma mjerenjem sfingomijelina, ceramida i S1P, uz lipidomiku i izotopno obilježavanje serinom. Usporedit će se učinci SCD inhibicije i palmitatnog preopterećenja te mogućnost spašavanja oleatom.
Cilj 5 usmjeren je na translacijsku validaciju u fiziološki relevantnijim uvjetima. Usporedit će se odgovori na SCD inhibitore i standardne AML lijekove u različitim medijima, uz metabolomsku i lipidomsku karakterizaciju te razvoj 3D modela koji uključuju leukemijske, stromalne i endotelne stanice. Nalazi će se usporediti s primarnim uzorcima i dostupnim in vivo podacima.
Očekivani rezultati
O1: Cilj je definirati vremenski slijed aktivacije odgovora na nesavijene proteine (UPR) nakon inhibicije SCD (SCDi) i preopterećenja palmitatom te utvrditi funkcionalnu ulogu pojedinih komponenti UPR-a u lipotoksičnosti. Farmakološkom inhibicijom, utišavanjem i prekomjernom ekspresijom ciljnih gena istražit će se imaju li pojedini odgovori citoprotektivnu ili citotoksičnu ulogu. Očekuje se razvoj verificiranih staničnih modela UPR-a te Q1 publikacija spremna za slanje krajem druge godine projekta. Rezultati će pridonijeti razumijevanju povezanosti lipidne biologije i UPR-a.
O2: Istražit će se promjene omjera NADP+/NADPH i NAD+/NADH tijekom SCDi- i palmitatom inducirane lipotoksičnosti. Za praćenje redoks statusa koristit će se fluorescentne sonde, uz validaciju enzimatskim metodama i LC-MS analizom. Ispitat će se uloga PARP1 i SIRT1 te potencijalni sinergizam SCD inhibitora s PARP i SIRT inhibitorima. Povezanost redoks promjena s UPR-om dodatno će se analizirati pomoću modela s utišanim CHOP i XBP1. Očekuje se Q1 publikacija do kraja treće godine, uz moguće translacijske implikacije za kombinirane terapijske pristupe u AML-u.
O3: Cilj je definirati metaboličku povezanost SCD inhibicije s putem metabolizma aktiviranih metilnih skupina te utvrditi njegovu ulogu u regulaciji NADP+/NADPH i NAD+/NADH. Moduliranjem MTHFD1/2 te GOT1 i ME1 istražit će se funkcionalna važnost ovog puta za lipotoksičnost. Projekt će istodobno generirati nove stanične modele za istraživanje metaboličkih mehanizama raka. Cilj će se provoditi tijekom treće do pete godine, uz planiranu Q1 publikaciju u petoj godini.
O4: Cilj je karakterizirati promjene sfingolipidne signalizacije tijekom SCDi- i palmitatom inducirane lipotoksičnosti te procijeniti ulogu ključnih sfingolipida i enzima u ovom procesu. Rezultati će prvenstveno poslužiti za generiranje novih hipoteza i razvoj budućeg istraživačkog projekta. Ako se pokaže da su promjene sfingolipida adaptivne, cilj će rezultirati kraćom publikacijom do završetka projekta.
O5: Cilj je razviti fiziološki relevantnije AML modele u Zagrebu optimizacijom metaboličkih uvjeta uzgoja. Metabolomski i lipidomski profili standardnih medija, uključujući HPLM, usporedit će se s plazmom periferne krvi i koštane srži AML bolesnika te mišjim modelima. Na temelju tih podataka razviti će se optimizirani uvjeti i 3D modeli koji uključuju leukemijske, stromalne i endotelne stanice. Modeli će se validirati prema osjetljivosti na lijekove i kliničkom odgovoru. Metabolička karakterizacija i optimizacija planirane su tijekom prve tri godine, uz Q1 publikaciju u četvrtoj godini. Uspješni modeli koristit će se za validaciju nalaza ostalih ciljeva i mogli bi imati širu primjenu u translacijskim AML istraživanjima.
Projektni tim
Popis osoba projektnog tima s Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
1. doc. dr. Vilma Dembitz
2. dr.sc. Damir Lisjak
3. doc. dr. Hrvoje Lalić
Popis osoba projektnog tima partnera
1. David Čičić, dr.med (KBD)
2. Lara Divjak, dr.med.(KBC)
3. dr. sc. Hannah Lawson (ICR)
4. dr. sc. Celine Philippe (Univ. de Rennes)