Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Sudbina amiloida mikrobiološkog podrijetla na sučelju crijevnog epitela
Naziv projekta na engleskom jeziku: Fate of Microbial Amyloid at the Gut Epithelial Interface
Akronim projekta: MAGE
Voditelj projekta: dr. sc. Jan Homolak, dr. med.
Ustrojbena jedinica: Klinička bolnica Dubrava, Hrvatska; Sveučilište u Tübingenu, Njemačka; New York Genome Center, SAD; Luxembourg Institute of Health, Luksemburg
Trajanje projekta: od 1. listopad 2026. do 30. rujan 2029. (36 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 199.999,95 €
Izvor financiranja: Hrvatska zaklada za znanost (HRZZ), Uspostavni istraživački projekti (UIP); šifra projekta: UIP-2026-5037
Opis projekta
Bakterijski amiloidi – proteinska vlakna koja proizvode mikroorganizmi – mogu poticati agregaciju proteina domaćina i u in vivo uvjetima pogoršavati bolesti povezane s amiloidima. Istaknuti primjer je curli, čija glavna podjedinica CsgA tvori izvanstanične fibrile koji predstavljaju ključne strukturne sastavnice bakterijskih biofilmova. Unatoč sve brojnijim dokazima o njihovim patološkim učincima, i dalje nije jasno kako ti mikrobni amiloidi prelaze crijevnu barijeru i dospijevaju u tkiva domaćina.
Projekt MAGE ima za cilj definirati mehanizme translokacije amiloida iz crijeva, njihovo širenje unutar organizma domaćina te u kojoj mjeri izloženost lijekovima modulira njihovu proizvodnju i aktivnost. Projekt se sastoji od tri međusobno komplementarna, ali neovisna radna paketa.
WP1 uspostavit će model praćenja in vivo inženjeringom kromosomski označene, fluorescentne verzije proteina CsgA u E. coli, uključujući sojeve bez CsgB – proteina potrebnog za učinkovitu nukleaciju amiloidnih vlakana – te varijante sa sporijom kinetikom agregacije. Ti će se sojevi koristiti za kolonizaciju miševa kondicioniranih antibioticima, čime će se omogućiti kvantitativno mapiranje raspodjele amiloida u tkivima primjenom fluorescentnog slikanja, imunohistokemije i transkriptomike na razini pojedinačnih stanica.
WP2 identificirat će mikrobne i farmakološke odrednice opterećenja amiloidima u crijevima, s naglaskom i na otkrivanje novih proteina koji tvore amiloide i na uvjete koji potiču CsgA-posredovanu sklapanje amiloida unutar biofilmova. Visokoprotočno probiranje definiranih i iz stolice izvedenih mikrobnih zajednica izloženih lijekovima odobrenima od strane FDA i EMA kombinirat će se s amiloid-specifičnim testovima, kvantifikacijom biofilmova, 16S profiliranjem, proteomikom i računalnim predviđanjima kako bi se generirao rangirani skup kandidata-mehanizama te interakcija između lijekova i mikrobioma.
WP3 ispitat će poboljšava li odabrani kandidat-lijek identificiran u WP2 širenje CsgA in vivo, narušava integritet crijevne barijere, potiče agregaciju proteina domaćina te mijenja ponašanje kod koloniziranih miševa.
Zajedno, ovaj integrirani pristup pružit će mehanistički okvir koji povezuje izloženost lijekovima, sastav mikrobioma i translokaciju bakterijskih amiloida s patologijom domaćina, uz istodobnu dostavu validirane eksperimentalne platforme i kandidata-meta za buduće dijagnostičke i terapijske strategije.
Ciljevi projekta
Opći cilj
Definirati mehanizme kojima crijevni mikrobni amiloidi, primjerice CsgA, prelaze crijevnu barijeru, šire se u organizmu domaćina i moduliraju amiloidozu domaćina, s posebnim naglaskom na ulogu sastava mikrobioma i izloženosti ksenobioticima.
Specifični ciljevi
1. Uspostaviti model praćenja translokacije amiloida iz lumena crijeva u organizam domaćina in vivo, primjenom SPF miševa kondicioniranih antibioticima i koloniziranih sojevima E. coli koji eksprimiraju označeni CsgA (WP1).
2. Mapirati raspodjelu bakterijskih amiloida u tkivima domaćina te identificirati tipove stanica posrednika u njihovom unosu i daljnjem transportu, primjenom fluorescentnog označavanja, imunohistokemije i analiza na razini pojedinačnih stanica (WP1).
3. Identificirati kanonske i skrivene mikrobne te farmakološke čimbenike koji određuju opterećenje amiloidima u crijevima, kombinirajući stratificirano probiranje mikrobnih zajednica, amiloid-specifične testove, profiliranje mikrobioma, proteomiku i računalno modeliranje (WP2).
4. Usporediti doprinos CsgA monomera i fibrila translokaciji kroz crijevni epitel primjenom sojeva divljeg tipa, sojeva bez CsgB te varijanti sa sporijom kinetikom fibrilacije (WP1).
5. Ispitati mijenja li interakcija odabranih lijekova i mikrobnih amiloida fiziologiju domaćina poticanjem sustavnog širenja, seedingom amiloida domaćina te promjenama ponašanja u SPF miševa kondicioniranih antibioticima (WP3).
Metodologija projektnog istraživanja
Istraživanje će se provoditi kroz tri međusobno povezana radna paketa koja obuhvaćaju razvoj modela praćenja, otkrivanje modulatora amiloidogeneze i validaciju učinaka in vivo.
Oprema i tehnike: bakterijska genetika i inženjering kromosomski označenih sojeva E. coli; anaerobne kulture i modeli biofilmova; fluorescentna mikroskopija i IVIS slikanje in vivo; elektronska mikroskopija; imunohistokemija; FACS sortiranje stanica; prostorna transkriptomika, proteomika i metagenomika; LC-MS/MS masena spektrometrija; biokemijski amiloidni testovi (ThT, Kongo crvenilo, ThS); računalna strukturna predviđanja i bioinformatička analiza; te bihevioralno testiranje miševa.
WP1 – Praćenje bakterijskih amiloida in vivo: generirat će se E. coli sojevi s fluorescentno i His-označenim CsgA, uključujući varijante s oštećenom ili usporenom fibrilacijom. Sojevi će se koristiti za kolonizaciju SPF miševa kondicioniranih antibioticima. Raspodjela amiloida u crijevima, perifernim organima i mozgu pratit će se fluorescentnim slikanjem, imunohistokemijom i jednostaničnim/prostornim transkriptomom kako bi se identificirale stanice domaćina uključene u unos i transport amiloida.
WP2 – Otkrivanje mikrobnih i farmakoloških modulatora: sintetske i humanе crijevne mikrobne zajednice izložit će se velikom panelu odobrenih lijekova u anaerobnim uvjetima. Opterećenje amiloidima, biomasa, stvaranje biofilma i sastav zajednice mjerit će se ThT/Kongo crvenilom, mjerenjem optičke gustoće, bojenjem crystal violetom i 16S rRNA sekvenciranjem. Interakcije amiloida s proteinima domaćina identificirat će se pulldown testovima, ekskluzijskom kromatografijom i LC-MS/MS, uz metagenomsko rudarenje i strukturno predviđanje. WP3 – Validacija patofizioloških učinaka: učinci odabranog kandidata-lijeka testirat će se u koloniziranim miševima. Procjenjivat će se širenje CsgA, sjemenjenje amiloida domaćina, integritet crijevne barijere te kognitivne i motoričke funkcije primjenom slikanja, imunohistokemije, histologije, analize ekspresije gena te testova otvorenog polja, rotaroda i Y-labirinta.
Očekivani rezultati
- Validirana platforma za praćenje bakterijskih amiloida in vivo* – generirat će se i validirati kromosomski označeni sojevi E. coli CsgA te model kolonizacije miševa koji omogućuje kvantitativno mapiranje translokacije amiloida iz crijevnog lumena u tkiva domaćina.
- Mapa raspodjele i staničnih puteva unosa CsgA – odredit će se raspodjela bakterijskih amiloida u crijevima, perifernim organima i mozgu te identificirati epitelne, imune i enteroglijalne stanice uključene u njihov unos i transport.
- Rangirani katalog lijekova i mikrobnih čimbenika koji moduliraju amiloidno opterećenje – visokoprobojnim probiranjem približno 1500 FDA/EMA odobrenih lijekova u sintetskim i humanim crijevnim zajednicama identificirat će se uvjeti i spojevi koji povećavaju ili smanjuju mikrobnu amiloidogenezu.
- Otkriće novih, nekanonskih mikrobnih amiloidnih proteina – kombinacijom funkcionalnih pulldown testova, proteomike, metagenomskog rudarenja i strukturnog predviđanja identificirat će se i karakterizirati dosad nepoznati amiloidni proteini mikrobnog podrijetla.
- Dokaz patofiziološke relevantnosti interakcija lijek–mikrobiom–amiloid – u modelu koloniziranih miševa testirat će se utječe li odabrani kandidat-lijek na širenje CsgA, sjemenjenje amiloida domaćina, integritet crijevne barijere i ponašanje, čime će se uspostaviti mehanistička poveznica između izloženosti lijekovima, mikrobioma i amiloidne patologije.
Projektni tim
Popis osoba projektnog tima s Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
1. Dr. sc. Jan Homolak
2. Doc. dr. sc. Ana Babić Perhoč
3. Luka Mihalic
4. Prof. dr. sc. Mihaela Perić
5. Dr. sc. Hana Čipčić Paljetak
6. Dr. sc. Mario Matijašić
7. Prof. dr. sc. Danka Grčević
8. Dr. sc. Matija Horaček
9. Prof. dr. sc. Danica Galešić Ljubanović
10. Prof. dr. sc. Davor Ježek
11. Izv. prof. dr. sc. Marina Radmilović
Popis osoba projektnog tima partnera
1. Dr. sc. Klara Zubčić
2. Prof. dr. sc. Lisa Maier
3. Prof. dr. sc. Sanja Vicković
4. Mihovil Joja