Opći podaci o projektu
Naziv projekta: Bioprintana sinovijalna ovojnica kao inovativni sustav za testiranje terapijskih intervencija u reumatoidnom artritisu
Naziv projekta na engleskom jeziku: Bioprinted synovium as a novel system for testing therapeutic interventions in rheumatoid arthritis
Akronim projekta: PRINTHERA
Voditelj projekta: doc. dr. sc. Alan Šućur, dr. med.
Ustrojbena jedinica: Katedra za fiziologiju i imunologiju, Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet
Partneri na projektu: Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, Slovenija (3D bioprintanje i biotinte), Kemomed d.o.o., Slovenija (3D in vitro modeli za testiranje lijekova), Klinički bolnički centar Zagreb (uzorci bolesnika)
Trajanje projekta: od 26. studenog 2025. do 25. studenog 2029. (48 mjeseci)
Ukupni iznos sredstava projekta: 80.000,00 €
Izvor financiranja: Nacionalni plan oporavka i otpornosti (NPOO); Institucionalni projekti (10106-25-2885)
Opis projekta
Reumatoidni artritis (RA) kronična je autoimunosna bolest zglobova. Bolest uzrokuje trajnu bol, oštećenje zglobova i invaliditet. Glavni procesi bolesti odvijaju se u sinovijalnoj ovojnici (sinoviji), tankom tkivu koje oblaže zglob. U RA sinovija postaje mjesto snažne upale. Sinovijalni fibroblasti i makrofagi proizvode upalne medijatore i enzime te privlače imunosne stanice iz krvi. Tako nastaje agresivno tkivo (panus) koje razara hrskavicu i kost.
Postojeći pretklinički modeli imaju ograničenja. Stanične kulture u dvije dimenzije (2D) ne oponašaju trodimenzionalnu (3D) građu sinovije ni odnose između stanica. Životinjski modeli razlikuju se od ljudi po imunosnom sustavu i tijeku bolesti. Zato lijekovi koji djeluju u životinjskim modelima često ne djeluju u bolesnika.
Projekt PRINTHERA razvija i validira 3D bioprintani model upaljene sinovije bolesnika s RA. 3D bioprintanje je tehnologija koja slaže biotintu (hidrogel sa živim stanicama) u slojeve prema digitalnom nacrtu. Model ima dva sloja, kao prirodna sinovija: intimu i subintimu. Tim upotrebljava sinovijalne fibroblaste i makrofage izdvojene iz tkiva bolesnika s RA te endotelne stanice. Za početnu optimizaciju tim upotrebljava imortalizirane stanične linije.
Projekt traje 48 mjeseci i ima četiri faze. Tim prvo uspostavlja protokole za izdvajanje stanica, odabire biotintu i optimizira bioprintanje. Zatim tim izrađuje i karakterizira dvoslojni model. U trećoj fazi tim dodaje u model monocite te T- i B-limfocite iz krvi bolesnika s RA. Tim prati kako te stanice putuju u model, kako se aktiviraju i kako djeluju na stanice sinovije. U četvrtoj fazi tim tretira model standardnim lijekovima za RA i mjeri smanjenje upale. PRINTHERA daje jednostavniju i dostupniju alternativu složenim sustavima organ-na-čipu (engl. organ-on-a-chip). Model služi za istraživanje mehanizama bolesti, otkrivanje novih terapijskih ciljeva i pretkliničko testiranje lijekova. Model sa stanicama pojedinog bolesnika otvara mogućnost personaliziranog ex vivo testiranja lijekova. Projekt slijedi načela 3R (zamjena, smanjenje i poboljšanje upotrebe životinja u istraživanjima).
Ciljevi projekta
Opći cilj
Razviti i validirati funkcionalni 3D bioprintani model upaljene sinovije u RA. Model sadrži primarne sinovijalne fibroblaste (RA-SF) i makrofage (RA-MAC) bolesnika s RA te mikrovaskularne endotelne stanice (HMVEC). Model služi kao platforma za istraživanje staničnih i molekularnih mehanizama RA, otkrivanje novih terapijskih ciljeva i pretkliničko testiranje terapija, uključujući personalizirane pristupe.
Specifični ciljevi
- Radni paket 1 (RP1): Uspostaviti i optimizirati temeljne komponente i protokole za 3D bioprintanje sinovije u RA: izdvajanje i karakterizaciju primarnih stanica, stanične linije (MH7A, THP-1, HMVEC), formulacije biotinti i parametre bioprintanja.
- RP2: Razviti i karakterizirati dvoslojni (intima i subintima) 3D bioprintani model sinovije, najprije sa staničnim linijama, zatim s primarnim stanicama bolesnika.
- RP3: Analizirati ključne značajke upalnog mikrookoliša u RA. Dodati u model monocite te T- i B-limfocite iz periferne krvi bolesnika i analizirati njihovu migraciju, aktivaciju i međudjelovanje sa stanicama modela.
- RP4: Validirati model kao alat za testiranje terapija. Izmjeriti odgovor modela na standardne lijekove za RA: metotreksat, inhibitor TNF-α i inhibitor JAK.
Metodologija projektnog istraživanja
Mjesto istraživanja. Laboratorij za molekularnu imunologiju (MOLIM), Hrvatski institut za istraživanje mozga, Medicinski fakultet.
Izdvajanje stanica. Tim prikuplja sinovijalno tkivo bolesnika s RA tijekom ugradnje endoproteze kuka ili koljena. Tim izdvaja fibroblaste (RA-SF) i makrofage (RA-MAC) enzimskom razgradnjom tkiva i sortiranjem stanica (BD FACSAria II). Monocite te T- i B-limfocite tim izdvaja iz periferne krvi bolesnika centrifugiranjem na gradijentu gustoće i sortiranjem stanica.
Stanične linije. Linije MH7A (sinovijalni fibroblasti RA), THP-1 (monociti, diferencirani u makrofage) i HMVEC služe za optimizaciju protokola i kao kontrola.
Biotinte i 3D bioprintanje. Tim ispituje biotinte od prirodnih polimera (hijaluronska kiselina, kolagen tipa I, GelMA, fibrin) i njihove mješavine. Ekstruzijski bioprinter Cellink BioX6 ispisuje dvoslojne konstrukte prema CAD nacrtu u pločice s 48 i 96 jažica.
Karakterizacija modela. Testovi vijabilnosti (Live/Dead, Annexin V/7-AAD), histologija (hematoksilin-eozin), imunofluorescencija i imunohistokemija. Konfokalni mikroskop Olympus FV3000 daje 3D rekonstrukciju modela. Protočni citometar Attune (Thermo Fisher) i RT-qPCR (Applied Biosystems 7500) određuju fenotip i aktivaciju stanica.
Imunosne stanice u modelu. Tim dodaje stanice iz krvi u Transwell umetak iznad modela. Tim mjeri migraciju stanica i analizira njihov fenotip i aktivaciju protočnom citometrijom i konfokalnom mikroskopijom.
Upalni medijatori. Multipleksna analiza (CBA) mjeri citokine u supernatantima (npr. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A).
Testiranje lijekova. Tim tretira modele s 3–5 koncentracija metotreksata, inhibitora TNF-α (infliksimab ili etanercept) i inhibitora JAK (tofacitinib ili baricitinib). Tim upotrebljava stanice 3–5 bolesnika po lijeku i mjeri upalne citokine, MMP-3 i aktivacijske biljege.Etika. Tim prikuplja uzorke uz odobrenje Etičkog povjerenstva i informirani pristanak bolesnika.
Očekivani rezultati
1. Protokoli i alati: standardizirani protokoli za izdvajanje i karakterizaciju RA-SF i RA-MAC (stanice ≥ 5 bolesnika), tri karakterizirane stanične linije, 1–2 odabrane biotinte i optimizirani parametri bioprintanja (vijabilnost stanica > 80 %).
2. Dvoslojni 3D bioprintani model sinovije sa staničnim linijama i s primarnim stanicama bolesnika: potvrđena građa (intima i subintima), vijabilnost > 70 % nakon ≥ 14 dana i osnovna funkcija (npr. proizvodnja IL-6 i MMP-3).
3. Model upalnog mikrookoliša u RA s imunosnim stanicama iz krvi bolesnika: karakterizirana migracija i aktivacija imunosnih stanica i profil ≥ 5 upalnih medijatora.
4. Validirani model za testiranje terapija: izmjeren odgovor modela na ≥ 2 standardna lijeka za RA i preliminarni podatci o razlikama među bolesnicima (stanice ≥ 3 bolesnika).
5. Znanstveni rezultati i razvoj kadrova: ≥ 2 znanstvena rada (Q1/Q2) u otvorenom pristupu, ≥ 3 kongresne prezentacije, 2 osposobljena doktoranda i 1 doktorska disertacija vezana uz temu projekta.
Projektni tim
Popis osoba projektnog tima s Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
1. doc. dr. sc. Alan Šućur, dr. med. – voditelj projekta
2. prof. dr. sc. Nataša Kovačić, dr. med.
3. doc. dr. sc. Ivan Padjen, dr. med.
4. Sara Priselac, dr. med. – doktorandica
5. Ivo Krešić, dr. med. – doktorand, Laboratorij za molekularnu imunologiju (MOLIM)
Popis osoba projektnog tima partnera
1. dr. sc. Mihovil Plečko, dr. med. – Klinika za ortopediju, KBC Zagreb
2. dr. sc. Boštjan Vihar – Institut za biomedicinske znanosti, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Slovenija
3. dr. sc. Vesna Kokondoska Grgič – Kemomed d.o.o., Slovenija
Diseminacija i vidljivost projekta
– Kongresi: EULAR, TERMIS i drugi međunarodni skupovi (≥ 3 prezentacije).
– Publikacije: dopunit će se tijekom provedbe projekta.
– Otvorena znanost: svi radovi u otvorenom pristupu; javno dostupni standardni operativni postupci (SOP); upravljanje podatcima prema načelima FAIR.
– Popularizacija znanosti: ≥ 2 aktivnosti (npr. javno predavanje, medijski članak) o 3D bioprintanju i istraživanju artritisa.
– Prijenos tehnologije: analiza patentabilnosti modela; kontakt s ≥ 1 tvrtkom iz farmaceutske industrije.
– Vidljivost financiranja: oznaka „Financirano od Europske unije – NextGenerationEU” i amblem EU-a na materijalima projekta.