Veličina fonta
Sivi ton
Kontrast
Disleksija

Studenti, nastavnici i ostali zaposlenici koji imaju simptome infekcije ili dokazanu bolest COVID-19 ili su bili u bliskom kontaktu s oboljelim osobama moraju se obvezno javiti elektroničkom poštom na adresu: covid-mef@mef.hr. Molimo studente, prilikom prijave obvezno ispunite i priložite svojem e-mailu upitnik koji se nalazi ovdje.

Projekt HRZZ: NORA

Projekt Hrvatske zaklade za znanost br. 2414, rok 2018-01

Notch signaling in osteoclast progenitors induced by rheumatoid arthritis

Akronim: NORA

Voditeljica projekta – prof.dr.sc. Danka Grčević

Trajanje projekta : 48 mjeseci – od 01.12.2018 do 30.11.2022

Financiranje projekta: 1.000.000 HRK (250.000 kn / godini)

Sažetak projekta:

Reumatoidni artritis karakteriziran je kroničnim upalnim odgovorom uz periartikularni i sustavni gubitak kosti uzrokovan pojačanom koštanom razgradnjom osteoklastima. S incidencijom od oko 1%, predstavlja značajan javnozdravstveni problem i pridonosi smanjenju kvalitete života. Osteokasti su velike multinuklearne stanice koje razgrađuju kost, a nastaju iz hematopoetskih stanica monocitno/makrofagne loze. Novije studije upućuju na moguću ulogu Notch signalnog puta u proliferaciji, diferencijaciji i migraciji stanica osteolastne loze. Međutim, točan mehanizam kako Notch signalni put djeluje u kontekstu artritisa nije poznat.

Glavni cilj predloženog projekta je definirati ulogu Notch signalnog puta u proliferaciji, migraciji i diferencijaciji osteoklastnih progenitora u artritisu te testirati ima li manipulacija Notch signalnog puta učinak na aktivnost osteoklastnih progenitora i osteoresortivni potencijal.

Korištenjem modela mišjeg artritisa izazvanog kolagenom (CIA) i uzoraka bolesnika s artritisom, cilj nam je razumjeti izražaj komponenti Notch sustava u pojedinim fazama tijekom diferencijacije osteoklasta i promjene izazvane artritisom, te učinke Notch-liganda na aktivnost osteoklastnih progenitora. Nadalje, planiramo testirati učinak inhibicije Notcha na proliferaciju, migraciju i diferencijaciju osteoklastnih progenitora in vitro. Kao in vivo model, primijenit ćemo neutralizacijska protutijela protiv Notcha i CreERT2 transgenične miševe u kojim će Notch signal biti inhibiran selektivno u osteoklastnim progenitorima koji izražavaju CX3CR1.

Mišji CIA-model omogućit će praćenje i modulaciju razvoja bolesti uzrokovane pojačanom osteoklastogenezeom i koštanom resorpcijom in vivo, dok će analiza ljudskih uzoraka omogućiti translaciju u kliničke uvjete. Karakterizacija Notch-signalnog puta u osteoklastnim progenitorima potaknutim artritisom pruža mogućnost razvoja terapijskih pristupa kojima će se kontrolirati njihova aktivnost, smanjujući time koštanu destrukciju uzorkovanu artritisom.

DETALJNIJE INFORMACIJE O PROJEKTU

Patogeneza artritisa

Reumatoidni artritis (RA) je sustavna upalna bolest čija je glavna manifestacija kronična upala više zglobova i osteodestrukcija, a uključuje složene interakcije imunosnog sustava, izvanstaničnog matriksa te koštanih stanica (Jung SM. J Immunol Res 2014). Ozbiljni klinički simptomi i kronični tijek bolesti obilježen trajnom upalom, progresivnim razaranjem zglobova i stalnom boli, zahtijevaju dugotrajnu primjenu lijekova, te unatoč terapiji rezultiraju značajnim koštanim deformacijama i invaliditetu na svjetskoj razini (Cross M. Ann Rheum Dis 2014). S prevalencijom od oko 1%, RA je jedna od najčešćih autoimunosnih bolesti u ljudskoj populaciji i predstavlja značajno opterećenje za zdravstveni sustav te smanjuje kvalitetu života, kao i njegovo očekivano trajanje.

RA i drugi upalni artritisi su karakterizirani kroničnim upalnim odgovorom, kao i periartikularnim te sustavnim gubitkom kosti zbog poremećaja koštanog metabolizma – razgradnje kosti od strane osteoklasta te stvaranja kosti od strane osteoblasta (Walsh NC. Immunol Rev 2010; Schett G. Arthritis Res Ther 2009; Goldring SR. Ann Rheum Dis 2013). Gubitak kosti u RA nastaje lokalno, na mjestima pogođenim bolešću, kao i sustavno, u obliku osteopenije i osteoporoze. Lokalne promjene se manifestiraju kao granične koštane erozije, subhondralna resorpcija kosti te periartikularni gubitak kosti. Težinu artritisa određuje odnos između razarajućih putova (proupalni citokini, molecule apoptoze, enzimi destruktivni za tkivo) te putova popravka (protuupalnih citokina, čimbenika rasta i diferencijacije) u zahvaćenim zglobovima (Sato K. Curr Opin Rheumatol 2006; McInnes IB. N Engl J Med 2011). Čimbenici poput terapije glukokortikoidima te imobilizacije doprinose razvoju lokalne i sustavne osteopenije (Komano Y. Arthritis Res Ther 2006).

Različiti životinjski modeli su još uvijek nezamijenjivi za bolje razumijevanje patogeneze artritisa, pri čemu je artritis potaknut kolagenom (CIA) najčešće korišteni pokusni model RA (Campbell IK. Eur J Immunol 2000). CIA model se dokazao kao snažno oruđe za identifikaciju patogenetskih mehanizama autoimunosti, kao i u osmišljavanju te isprobavanju novih potencijalnih lijekova (Hegen M. Ann Rheum Dis 2008; Bevaart L. Arthritis Rheum 2010; Billiau A. Cyt Grow Fac Rev 2011).

Iako su se mnoga istraživanja usredotočila na patogenezu RA, osobito njegovu etiologiju i nastanak, brojna pitanja ostaju neodgovorena, posebice uzroci trajnog održavanja kronične upale te obnavljanja stanica koje resorbiraju kost (Sucur A. Int Orthop 2014, Goldring SR. Ann Rheum Dis 2013). Osim toga, gubitak kosti, kao posljedica kronične upale, predstavlja ozbiljnu komplikaciju povezanu s artritisom, kao i drugim upalnim procesima, primjerice lokaliziranim bakterijskim infekcijama, kroničnim virusnim infekcijama, upalnim bolestima crijeva te nekim drugim autoimunosnim bolestima (Sato K. Curr Opin Rheumatol 2006; Ochi S. Proc Natl Acad Sci USA 2007; Takayanagi H. Nat Rev Immunol 2007).

Razaranje kosti u RA

Poremećaj strukture zgloba i koštane erozije su jedna od glavnih obilježja RA, no pojavljuju se i u drugim erozivnim oblicima artritisa (Goldring SR. Ann Rheum Dis 2013; Braun T. Arthritis Res Ther 2011; Komatsu N. Adv Immunol 2012; Deal C. Curr Rheumatol Rep 2012; Bartok B. Immunol Rev 2010; Kinne RW. Arthritis Res Ther 2007; Finzel S. Ann Rheum Dis 2013). Upaljeno sinovijalno tkivu u RA, s pojačanom vaskularizacijom, hiperplazijom te nakupljanjem makrofaga, plazma stanica, limfocita T i B, dendritičkih stanica (DC), prirodnoubilačkih (NK) stanica te mastocita, prodire u susjedne strukture (zglobnu hrskavicu, površinu kortikalne kosti te podležeću koštanu srž) (Bartok B. Immunol Rev 2010; Kinne RW. Arthritis Res Ther 2007). Uz sinovitis, upalni infiltrat se također nalazi u subhondralnoj i periartikularnoj koštanoj srži, a prikazuje se kao edem koštane srži (upalom izazvano nakupljanje tekućine u odjeljku koštane srži) na magnetskoj rezonanci (MRI) te kao osteitis (pojačana vaskularizacija i zamjena masti koštane srži s upalnim stanicama) na histološkim preparatima (Grcevic D. J Rheumatol 2010; Schett G. Ann Rheum Dis 2010). Osim toga, u raznim oblicima artritisa je uočeno i prisutstvo sustavnog gubitka kosti, koje se očituje kao smanjena mineralna gustoća kosti te povećana incidencija prijeloma, te je povezano s težinom artritisa. Iako se sustavna osteoporoza u artritisu obično pripisivala smanjenoj pokretljivosti te terapiji glukokortikoidima, novija istraživanja sugeriraju kako su sustavna osteopenija, kao i periartikularni gubitak kosti i lokalne erozije, barem djelomično uzrokovani zajedničkim patogenim mehanizmom koji uključuje upalom potaknuto povećanje aktivnosti i broja osteoklasta (Schett G. Ann N Y Acad Sci 2009; Choi Y. Nat Rev Rheumatol 2009; Corrad A. Clin Dev Immunol 2013; Haynes DR. Arthritis Res Ther 2007).

Stanice osteoklastne linije

Za nastanak koštanih erozija ključni su osteoklasti, izrazito specijalizirane koštane stanice sposobne za resorpciju mineraliziranog matriksa (Le Goff B. Joint Bone Spine 2013). One nastaju od mijeloidnih hematopoetskih progenitora monocitno/makrofagne stanične linije kroz niz diferencijacijskih faza, pri čemu se stvaraju velike, multinuklearne stanice koje razgrađuju kost i pozitivne su za kiselu fosfatazu otpornu na tartarat (TRAP) (Lorenzo J. Endocr Rev 2008; Boyce BF. Arch Bichem Biophys 2008).

Diferencijaciju osteoklasta fiziološki potiče vezanje liganda receptora aktivatora jezgrenog čimbenika kΒ (RANKL) na njegov receptor RANK, u prisutstvu čimbenika stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF/CSF-1) (Arai F. J Exp Med 1999; Asagiri M. Bone 2007; Nakashima T. Ann NY Acad Sci 2011), a te ključne osteoklastogene molekule su obilato izražene u upalnim stanjima poput artritisa i periodontitisa (Takayanagi H. Nat Rev Rheumatol 2009; Komatsu N. Adv Immunol 2012). Stvaranje RANKL-a, koji je izražen na osteoblastima i hipertrofirajućim hondrocitima, kao i aktiviranim limfocitima T i sinovijalnim fibroblastima, potiču  proresorptivni hormone, citokini i upalni medijatori, uključujući vitamin D3, paratireoidni hormone, prostaglandin E2 (PGE2), IL-1, IL-6, IL-7, IL-15, IL-17, IL-21 and IL-22 (Braun T. Arthritis Res Ther 2011; Komatsu N. Adv Immunol 2012). RANKL signalni put inhibira osteoprotegerin (OPG), topljivi lažni  receptor RANKL-a, a RANKL/OPG omjer je ključna odrednica brzine osteoklastogeneze i koštane resorpcije (Braun T. Arthritis Res Ther 2011; Boyce BF. Arch Biochem Biophys 2008).

M-CSF, kroz svoj receptor cFms (CSF-1R/CD115), potiče proliferaciju osteoklastnih progenitora (OCP), podržava njihovo preživljavanje te pojačava izražaj RANK-a (Asagiri M. Bone 2007; Nakashima T. Ann NY Acad Sci 2011). RANK koristi adaptorske molekule iz TRAF (čimbenik povezan s TNF receptorom) obitelji, poglavito TRAF6, te započinje više signalnih putova (uključujući NF-κB, proteinske tirozin kinaze (BtK/Tec), signalizacija kalcijem te putove mitogenom-aktiviranih proteinskih kinaza (MAPK) (p38 i Erk). Ove signalne kaskade snažno induciraju transkripcijski factor NFATc1 (jezgreni čimbenik aktiviranih limfocita T, citoplazmatski 1), koji međudjeluje s drugim suradnicima (npr. kompleks aktivatorskog proteina 1 (AP-1) koji sadrži cFos) kako bi se aktivirao transkripcijski skup za osteoklaste (Braun T. Arthritis Res Ther 2011; Komatsu N. Adv Immunol 2012). Kostimulacijski receptori OSCAR (s osteoklastom povezani receptor) i TREM2 (receptor okidač izražen na mijeloidnim stanicama 2) pojačavaju osteoklastogeni signal (Braun T. Arthritis Res Ther 2011; Komatsu N. Adv Immunol 2012; Asagiri M. Bone 2007; Nakashima T. Ann NY Acad Sci 2011). Signalni putovi koji reguliraju proliferaciju OCP, fuziju osteoklasta i njihovo preživljavanje potencijalno utječu na broj i aktivnost osteoklasta diferenciranih stimulacijom progenitora M-CSF-om/RANKL-om (Feng X. IUBMB Life 2005; Maeda K. Nat Med 2012; Park KH. Cell Commun Signal 2013). Notch signalni put je važan, no nepotpuno razjašnjen put, za kojeg je predloženo više mogućih uloga u diferencijaciji osteoklasta (Duan L. Front Biosci 2008).

Notch signalni put u biologiji kosti

Notch je komunikacijski put među stanicama s višestrukim funkcijama u zdravlju i bolesti (Feng X. IUBMB Life 2005; Fukushima H. Mol Cell Biol 2008). Uloga Notch signalnog puta u diferencijaciji osteoklasta je kontroverzna, s suprostavljenim pokusnim dokazima koji sugeriraju i stimulatornu i ihibitornu ulogu (Ashley JW. J Cell Biochem 2015). Suprostavljeni nalazi vjerojatno proizlaze iz razlika u pokusnom pristupu te upućuju da uloga Notch signalnog puta u osteoklastima ovisi o kontekstu.

Notch je receptor na staničnoj površini koji jednom prolazi kroz membranu. Postoje četiri Notch receptora (Notch1-Notch4) u sisavaca. Nakon vezanja Jagged ili Delta-nalik liganda koji su vezani za površinu susjednih stanica, kompleks γ-sekretaze cijepa transmembransku regiju Notcha. Notch unutarstanična domena (NICD) se oslobađa sa membrane i premješta u jezgru, gdje se veže za transkripcijski faktor protein koji veže rekombinacijski signal za κ J regiju immunoglobulina (Rbpjκ), a koji je prisutan na promotorima ciljnih gena Notcha. NICD uklanja korepresore sa Rbpjκ te privlači koaktivatore, kao Mastermindu-nalik 1 (Maml1), kako bi potaknuo izražaj ciljnih gena kao što su Hes i Hey obitelji (Regan J. Curr Osteoporos Rep 2013).

Prethodna istraživanja upućuju da Notch1 i Notch2 imaju posebne funkcije u koštanim stanicama te da precizna kontrola njihove aktivnosti je presudna za održavanje koštanog remodeliranja (Wilson JJ. Cell 2006). Nezavisna istraživanja pokazala su da Notch1 stimuliran pomoću Jagged1 (JAG1) potiskuje diferencijaciju osteoklasta, dok Notch2 stimuliran pomoću Delta-nalik 1 (DLL1) potiče diferencijaciju osteoklasta (Bai S. J Biol Chem 2008; Fukushima H, Mol Cell Biol 2008; Schwarzer R. Leukemia 2008; Sekine C. Arthritis Res Ther 2012; Sethi N. Cancer Cell 2011; Yamada T. Blood 2003; Zhou J. Calcif Tissue Int 2014; Zhou J. Calcif Tissues Int 2015). Istraživanje Ashley et al. je proučavalo uloge Notch signalnog puta u diferencijaciji osteoklasta koristeći stimulaciju imobiliziranim ligandima JAG1 ili DLL1, ili supresiju inhibitorom γ-sekretaze (GSI) DAPT ili transkripcijskih inhibitorom SAHM1. Ustanovili su da Notch stimulacija inhibira usmjeravanje stanica prema diferencijaciji u osteoklaste, no potiče sazrijevanje i funkcioniranje već usmjerenih OCP (Ashley JW. J Cell Biochem 2015). Nedavna istraživanja Canalisove grupe koristila su mišji model Hajdu Cheneyovog sindroma, bolesti karakterizirane Notch2 mutacijom s dobitkom funkcije. Križali su miševe s uvjetovanim Notch2 izražajem s odgovarajućim Cre upravljačima kako bi unijeli mutaciju u osteoklastne (Lyz2Cre) ili osteoblastne (BGLAP-Cre) linije te uočili povećani broj preosteoklastnih stanica, pojačanu diferencijaciju osteoklasta te pojačanu koštanu resorpciju u odgovoru na RANKL (Canalis E. J Biol Chem 2016). Kontinuirana aktivacija Notch2 signalnog puta u osteoblastima, no ne u osteoklastima, vodi do generalizirane osteopenije povezane s pojačanom resorpcijom kosti i smanjenom endokortikalnom brzinom odlaganja mineralnog matriksa (Zanotti S. J Biol Chem 2017). U kontekstu artritisa, pokazano je da Notch signalni putovi posreduju sinovijalnu angiogenezu u odgovoru na endotelni čimbenik rasta krvnih žila te angiopoetin 2 (Gao W. Ann Rheum Dis. 2013).

Iako su genetski pristupi neprocjenjivi u proučavanju uloge Notch signalnog puta u modelima bolesti, farmakološke intervencije su potrebne kako bi se ostvario terapijski potencijal inhibicije Notcha (Wu Y. Nature 2010). Nespecifično blokiranje Notch signalnom puta upotrebom GSI dovodi do ozbiljnih nuspojava, te je zbog toga pažnja usmjerena na ciljanje pojedinačnih Notch liganda i receptora u miševa koristeći novorazvijena učinkovita i specifična neutralizirajuća humanizirana monoklonska protutijela. Daljnja istraživanja su potrebna kako bi se razjasnila uloga Notch signalnog puta tijekom razvoja artritisa in vivo na različitim stupnjevima diferencijacije osteoklasta. Djelovanje na Notch signalni put u artritisu ima potencijal da inhibira novačenje, umnažanje ili diferencijaciju OCP, rezultirajući smanjenom koštanom resorpcijom.

Ciljevi projekta

  • Cilj nam je identificirati izražaj Notch receptora i nizvodnih transkripcijskih meta Notch aktivacije na različitim stupnjevima diferencijacije mišjih i ljudski osteoklastnih progenitora
  • Uz to, planiramo analizirati učinak Notch liganda na proliferaciju, diferencijaciju, migraciju te funkcionalnu aktivnost mišjih i ljudskih osteoklastnih progenitora
  • Koristeći mišji model CIA i uzorke bolesnika s RA, analizirat ćemo promjene u izražaju Notch receptora i Notch transkripcijskih meta u OCP vezano za artritis
  • Dodatno, očekujemo da ćemo definirati svojstva upalnog mikrookoliša u kontekstu izražaja Notch liganda te njihovu ulogu u navođenju, migraciji, diferencijaciji i aktivaciji OCP
  • Planiramo analizirati migraciju i diferencijacijski potencijal označenih OCP u mišjem modelu CIA koristeći CX3CR1CreERT2 mišju liniju koja će nam omogućiti prostornu i vremensku aktivaciju vizualnog biljega
  • Planiramo rasvijetliti učinke modulacije Notch signalnog puta neutralizirajućim protutijelima na diferencijaciju ranih progenitora u zrele osteoklaste, kao i učinke na njihovu migraciju i funkciju tijekom artritisa
  • Uz to, u uzorcima iz bolesnika s artritisom namjeravamo analizirati učinke neutralizacije Notch signalnog puta na proliferaciju, diferencijaciju te sazrijevanje ljudskih osteoklasta
  • Indukcijom CIA u mišjem modelu CX3CR1CreERT2/∆Rbpjκ∆, planiramo proučiti učinak genetski inducirane Notch inhibicije tijekom progresije bolesti u kontekstu povećane osteoklastogeneze te pojačane koštane resorpcije in vivo

Hipoteza

Hipoteza nam je da Notch aktivacija ima važnu ulogu u proliferaciji, diferencijaciji, migraciji i funkcionalnoj aktivnosti mišjih i ljudskih OCP induciranih artritisom. Odgovor induciranih OCP povezanih s artritisom uključuju aktivaciju, novačenje te navođenje OCP u subhondralnu regiju te oštećenja zglobova te njihovo sazrijevanje u zrele osteoklaste koji resorbiraju kost. Stoga, očekujemo da bi inhibicija Notch signalnog puta mogla smanjiti aktivnost OCP te njihovu sposobnost koštane resorpcije, time nudeći potencijal novog terapeutskog pristupa za tretmant gubitka kosti izazvanog upalom.

OČEKIVANI REZULTATI I UČINAK ISTRAŽIVANJA

Očekivani rezultati

– Potvrda porasta izražaja Notch liganda i receptora, kao i Notch transkripcijskih meta povezanih s mišjim i ljudskim artritisom

– Karakterizacija učinaka Notch signalnog puta u proliferaciji, diferencijaciji, migraciji i funkcionalnoj aktivnosti mišjih i ljudskih osteoklastnih progenitora u kontekstu artritisa

– Identifikacija migracijskog obrasca i diferencijacijskog potencijala označenih osteoklastnih progenitora koristeći CX3CR1CreERT2 mišju liniju koja omogućava specifičnu prostornu i vremensku aktivaciju vizualnog biljega

– Rasvijetliti učinke suprimiranja Notch signalnog puta neutralizirajućim protutijelima na diferencijaciju mišjih i ljudskih osteoklasta, kao i njihovu migraciju i funkciju tijekom artritisa

– Odrediti učinak genetski potaknute inhibicije Notcha u CX3CR1CreERT2/∆Rbpjκ∆ miševa tijekom progresije bolesti u kontekstu povećane osteoklastogeneze i povećane koštane resorpcije

Učinak istraživanja

Ostvarivanjem ciljeva projekta, očekujemo sljedeće ishode i korisni učinak za instituciju domaćina, kao i općenito za hrvatsku znanstvenu zajednicu:

  • Uspostavljanje međunarodno konkurentnih istraživačkih grupa. Naši nalazi će pridonijeti polju biologije kosti kroz otkrivanje mehanizama ključnih za razumijevanje složenih mehanizama kojima Notch signalni put mijenja diferencijacijski potencijal i aktivnost osteoklasta tijekom kronične upale, a koja je sastavni dio mnogih patoloških procesa. Predloženi projekt će potaknuti suradnju komplementarnih istraživačkih grupa (koje sudjeluju u projektu) u interdisciplinarnom polju osteoimunologije/reumatologije. Transfer tehnologije i istraživačkog/menadžerskog iskustva će povećati znanstvenu kompetenciju istraživačke grupe.
  • Razvoj hrvatske znanstvene i istraživačke zajednice. Rezultati predloženog istraživanja će proširiti znanje o području kroz karakterizaciju uloga Notch signalnog puta u proliferaciji, diferencijaciji, migraciji i funkcionanoj aktivnost mišjih i ljudskih osteoklastnih progenitora u kontekstu artritisa. Znanstvena ostvarenja će se diseminirati na lokalnim i inozemnim znanstvenim skupovima, simpozijima te sveučilištima (web stranice, predavanja, radionice) te pružiti osnovu za buduće prijave za izvore financiranja. D. Grčević prisno surađuje sa suradnicima iz više istraživačkih grupa u SAD i Europi te će aktivno nastojati privući međunarodno financiranje na MefZg (npr. projekt European Calcified Tissue Society, suradnici u području osteoimunologije/reumatologije unutar HORIZON sheme).
  • Usavršavanje mladih znanstvenika. Prijenos znanja poticat će se uključivanjem mladih znanstvenika u nove i konkurentne znanstvene pristupe na MefZg te tijekom istraživačkih posjeta suradničkim ustanovama (prof.dr.sc. Kalajzić na University of Connecticut, CT, SAD). Planirana su ukupno četiri posjeta tijekom trajanja projekta kako bi se uvježbali istraživači u tehnikama oslikavanja kosti te prenio životinjski transgenični model. Posjeti će potpomoći prijenos optimizirane metodologije u laboratorij D. Grčević na MefZg te će pomoći u stvaranju potpuno suvremenog laboratorija u istraživačkom polju osteoimunologije/reumatologije.
  • Osnaživanje mentorskih kapaciteta. Iskustvo u istraživačkim i organizacijskim aktivnostima vezano za projekt će pomoći dr. Grčević u daljnjem profiliranju sebe i svog istraživačkog tima kao stručnjaka u polju osteoimunologije/reumatologije, te će pojačati istraživačku konkurentnost i mentorske kapacitete za usavršavanje i podučavanje mladih znanstvenika na MefZg. Predloženi pristupi proširit će mogućnosti primjene, kao i povećati iskoristivost kapitalne opreme institucije, uključujući PCR u stvarnom vremenu SDS7500; FACSAria razvrstavač stanica; mikro-CT SkyScan1076; IVIS Spectrum in vivo sustav za praćenje; pretklinički MRI 7T.
  • Diseminacija i publikacija rezultata istraživanja. Rezultati dobiveni tijekom projekta bit će redovito izlagani na vodećim znanstvenim konferencijama (European Congress of Immunology, European Calcified Tissue Sociaty Meetings, itd.) te objavljeni u visoko-rangiranim znanstvenim časopisima (Front in Immunology, Eur J Immunol, Arth Res Ther, itd.). Ove aktivnosti će doprinijeti međunarodnoj prepoznatljivosti podupiruće institucije, voditelja projekta (D. Grčević), kao i članove njene grupe kao konkurentnih istraživača.
  • Mogući korisnici rezultata projekta. Naše istraživanje moglo bi imati kliničku važnost kroz potencijal osmišljavanja novih terapeutskih pristupa kojima bi se diferencijacija i aktivnost osteoklasta mogla mijenjati kontroliranjem Notch signalnog puta. Postupak inhibicije Notch-a se već provodi u klinici, bilo kao odobrena terapija ili u različitim fazama kliničkih istraživanja. U ovom projektu, usredotočit ćemo se na ulogu Notch signalnog puta u bolesnika s artritisom, a što predstavlja novi terapijski pristup.

METODOLOGIJA I FINANCIRANJE

Metodologija

Za potrebe projekta koristit ćemo mišji model CIA i uzorke bolesnika s RA. Većina postupaka koji se odnose na model CIA i njegovu primjenu u miševa soja C57BL/6, postupke analize osteoklasta in vitro, imunofenotipizaciju hematopoetskih stanica, stanično razvrstavanje te analizu ljudskih uzoraka, već se dulje vrijeme koristi u uključenim laboratorijima te ne očekujemo veće tehničke poteškoće s njihovom primjenom tijekom projekta. Prethodna istraživanja provedena na mišjem modelu CIA i uzorcima bolesnika s artritisom potvrđuju prikladnost predložene metodologije za provjeru postavljene hipoteze. Novi postupci koji će biti uvedeni tijekom projekta su: procjena učinka imobiliziranih liganda Notch na sazrijevanje specifičnih subpopulacija osteoklastnih prethodnika (OCP) potaknutih artritisom; neutralizacija signalizacije Notch in vivo s pomoću humaniziranog monoklonskog protutijela IgG1, specifičnog za Notch1 ili Notch2; uspostava linije transgeničnih miševa CX3CR1CreERT2 s ciljem prikaza i praćenja OCP in vivo, te uspostava linije s trostrukim transgenom, s ciljem uvjetne ablacije gena Notch u subpopulaciji OCP CX3CR1+. Opisane mišje linije bit će uspostavljene uz pomoć suradnika na predloženom projektu, Prof. Kalajzić, s kojim D. Grčević već dugi niz godina uspješno surađuje.

Financiranje

Ukupni budžet projekta: 1.000.000,00 kn (250.000,00kn/godini)

SUDIONICI PROJEKTA I OPREME

Voditeljica projekta

Prof. dr. sc. Danka Grčević, dr.med.

Zavod za fiziologiju i imunologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Laboratorij za molekularnu imunologiju, Hrvatski institut za istraživanje mozga, Zagreb

Istraživačka grupa

Danka Grčević, prof.dr.sc., Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu (MefZg)
Nataša Kovačić, prof.dr.sc., MefZg
Vedran Katavić, prof.dr.sc., MefZg
Zrinka Jajić, prof.dr.sc., MefZg
Alan Šućur, dr.sc., MefZg
Darja Flegar, dr.sc., MefZg
Marina Ikić Matijašević, dr.sc., KB Sveti Duh
Katarina Barbarić Starčević, dr.sc., KBC Zagreb
Ivo Kalajzić, prof.dr.sc., University of Connecticut Health Center
Katerina Zrinski Petrović, lab. tehničar, MefZg
Maša Filipović doktorand, dr. med., MefZg

Oprema

Laboratorij za molekularnu imunologiju i staničnu kulturu, smješten na Hrvatskom institutu za istraživanje mozga, MefZg, uključuje dva laboratorija i kabinet

Prvi laboratorij koristi se za rutinske laboratorijske postupke, histologiju, postupke ELISA i Western-blot, označavanje stanica, izolaciju proteina, siRNA transfekciju, PCR i itd. Ova prostorija je opremljena s dvjema hlađenim centrifugama, standardnom PCR jedinicom (2700, Applied Biosystems – Life Technologies), uređajima za elektroforezu DNA i proteina, UV/VIS spektrofotometrom (Eppendorf BioSpectrometer), autoklavom, sonikatorom (Osonica Sonicator Q500, Fisher Scientific), pH-metrom (Accumet pH Meter 925, Fisher Scientific), čitač ELISA mikropločica (Dynatech MR5000 Microplate Reader) te nekoliko standardnih laboratorijskih dodataka i uređaja (vodena kupelj, magnetska mješalica, vortekser, frižideri, pipetori, vakuum-pumpa, vaga itd.).

Drugi laboratorij koristi se za kulturu stanica i analizu izražaja gena. Ova prostorija je opremljena s CO2 inkubatorima (Heracell 150, Haereus), sterilnim kabinetom (Aura-V, Ehret), spektrofotometrom (NanoDrop 1000, Thermo Scientific), centrifugama s hlađenjem (Hettich Universal 32R and Hettich Micro 120), vakum-centrifugom (Concentrator 5301, Eppendorf) i intrumentom za PCR u stvarnom vremenu (ABI7500 SDS, Applied Biosystems – Life Technologies). Prostorija je također opremljena s rutinskim malim laboratorijskim uređajima (blok za grijanje, vortekser, centrifuge, pipetori, frižideri itd.).

Kabinet se koristi za mikroskopiranje te histomorfometriju te je opremljen invertnim fluorescentnim mikroskopom (Axiovert 200, Carl Zeiss), s kamerom i programom za analizu slika (AxioVision, Carl Zeiss), i lupom (AxioZoom V8, Carl Zeiss).

Zajednički laboratoriji i kapitalna oprema na Institutu uključuju: tamnu komoru s opremom za vizualizaciju/fotografiranje i razvoj filma, molekularnu jedinicu opremljenu elektoporetskim tranfektatorom (Neon, Invitrogen by LT), ultracentrifugu, histološki rezač za smrznute uzorke (Leica CM-3050S), ELISA-čitač (Model 680, Bio-Rad Laboratories), hladnjake -80°C, autoklav i preciznu vagu.

Vivarij se nalazi na Institutu te je certificiran za uzgoj i održavanje pokusnih miševa te pruža potrebne uvjete za model CIA, a uključuje i laboratorij za in vivo postupke, sterilne kabinete za kaveze tijekom praćenja i druge usluge potrebne za rad s pokusnim životinjama.

Odjeljak za protočnu citometriju opremljen je s protočnim citometrom s dva lasera (Attune, Applied Biosystems by LT) za analizu 8 parametara (SSC, FSC, šest fluorokroma) te staničnim sorterom opremljenom s tri lasera (FACSAria I, BDB) koji može analizirati 11 parametara (SSC, FSC, devet fluorokroma).

Laboratorij za mikroskopiju i morfometriju na Zavodu za anatomiju, MefZg, koristi se za histološke tehnike i opremljen je rotacijskim mikrotomom (Leica) i fluorescentnim mikroskopom (AxioImager, Carl Zeiss) s kamerom i programom za analizu i rekontrukciju slika (Osteomeasure, Ostometrix). Uređaj za magnetsku rezonancu (MR) za pred-kliničku aplikaciju (Preclinical MRI BioSpec 7T, Bruker), mikro-komjuteriziranu tomografiju (SkyScan1076, SkyScan) i laboratorij s tehnologijom za in vivo praćenje (IVIS Spectrum, pred-klinički in-vivo sustav za oslikavanje, PerkinElmer) također se nalaze na Zavodu za anatomiju.

REZLTATI PROJEKTA

1. godina

PUBLIKACIJA: A. Inforzato, R. Parente, C. Sobacchi, B. Bottazzi, A. Mantovani, D. Grcevic. The long pentraxin PTX3 in bone homeostasis and pathology. Frontiers in Immunology. 2019.

DankaFrontiers

PUBLIKACIJA: A. Sucur, Z. Jajic, M. Ikic Matijasevic, A. Stipic Markovic, D. Flegar, N. Lukac, T. Kelava, N. Kovacic, D. Grcevic. Combined manual and automated immunophenotypisation identified disease-specific immune subpopulations in rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis and psoriatic arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2019

SucurCER

SAŽETAK, POSTER I USMENO IZLAGANJE: N. Lukač, A. Šućur, D. Flegar, T. Kelava, K. Zrinski Petrović, D. Šisl, V. Katavić, D. Grčević, N. Kovačić. Mid1 is a novel mediator of subchondral bone resorption in antigen-induced arthritis. ECTS 2019. Calcif Tissue Int 2019:S39

NinaECTS2019ppt
NinaECTS2019abstract
NinaECTS2019poster

SAŽETAK I POSTER: A. Sucur, Z. Jajic, M. Ikic Matijasevic, M. Artukovic, D. Flegar, N. Lukac, T. Kelava, A. Markotic, N. Kovacic, D. Grcevic. Association of T-cell and B-cell aberrancies with disease activity in rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis. ECTS 2019. Calcif Tissue Int 2019:S113

AlanECTS2019poster
AlanECTS2019abstract

SAŽETAK: N. Lukač, D. Flegar, T. Kelava, A. Šućur, K. Zrinski Petrović, D. Šisl, M. Filipović, V. Katavić, D. Grčević, N. Kovačić. The role of Mid1-PP2A axis in inflammation-induced joint damage in antigen-induced arthritis. 2019 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society abstract book. 2019:52

NinaHID2019bstract

SAŽETAK I USMENO IZLAGANJE: D. Flegar, A. Šućur, A. Markotić, M. Filipović, N. Lukač, D. Šisl, N. Kovačić, T. Kelava, V. Katavić, K. Zrinski Petrović, D. Grčević. The effect of CCL2/CCR2 signaling blocade on bone resorption and osteoclast progenitors in collagen induced arthritis. 2019 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society abstract book. 2019:24

DarjaHID2019abstract

SAŽETAK: A. Špehar Uroić, M. Filipović, D. Flegar, A. Šućur, N. Kovačić, D. Grčević. Immunophenotyping of chemokine receptors on peripheral blood mononuclear cells in children with type 1 diabetes. 2019 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society abstract book. 2019:51

MasaHID2019abstract

SAŽETAK I USMENO IZLAGANJE: D. Flegar, A. Šućur, A. Markotić, N. Lukač, D. Šisl, N. Kovačić, T. Kelava, V. Katavić, K. Zrinski Petrović, D. Grčević. The effect of inhibition of CCL2/CCR2 signaling on myeloid lineage cells and osteoclast progenitor subpopulation in collagen induced arthritis.  5th International Conferenceof translational medicineon pathogenesis and therapy of immunomediated diseases (2019, Milano)

DarjaSIICA2019poster

SAŽETAK I USMENO IZLAGANJE: N. Lukač, A. Šućur, D. Flegar, T. Kelava, K. Zrinski Petrović, V. Katavić, D. Grčević, N. Kovačić. Mijeloidno-specifični molekularni posrednici subhondralnog koštanog razaranja u mišjem modelu reumatoidnog artritisa. 1. Simpozij Perović – Krmpotić Nemanić: Knjiga sažetaka. 2019:12

NinaKrmpotic2019abstract
NinaKrmpotic2019poster

2. godina

… provedba projekta u tijeku …

3.godina

… provedba projekta u tijeku …

4.godina

… provedba projekta u tijeku …